miR-18a增強肺腺癌干細胞樣細胞放射敏感性的研究.pdf

1、目前，隨著發(fā)病率和死亡率的不斷增加，癌癥已經(jīng)成為中國疾病致死的首要因素。最新的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2015年中國有超過429.2萬新診斷的癌癥患者，超過281.4萬人因癌癥致死。肺癌是我國乃至全球最常見的惡性腫瘤，其總發(fā)病率和死亡率逐年上升，均居于惡性腫瘤第一位。放射治療是目前肺癌的主要治療手段之一。然而，非小細胞肺癌(NSCLC)尤其是肺腺癌細胞對放射線抗拒，導致肺癌患者放療后效果不佳。近年來，越來越多的研究證實，腫瘤干細胞(Cancer

2、stem cells，CSCs)是腫瘤放射抗拒的根源。因此，從腫瘤干細胞層面探索其放療抗拒的機制，為靶向殺傷腫瘤干細胞提供實驗依據(jù)，是未來基因-放射治療的新途徑。微小RNA(microRNA，miRNA)作為一種非編碼的RNA分子，參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，發(fā)揮著促癌或抑癌的作用。并且，一些miRNAs參與調(diào)控腫瘤干細胞的部分生物學功能，如腫瘤干細胞的自我更新、多向分化及放化療抵抗性等。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-18a在CD133+

3、肺腺癌干細胞樣細胞中低表達，而miR-18a可提高普通肺腺癌細胞(A549)的放射敏感性。那么，miR-18a能否調(diào)控肺腺癌干細胞樣細胞放射敏感性呢，能否作為放射線靶向靶傷肺腺癌干細胞的分子靶點呢？本項目擬從miR-18a入手，探索其在CD133+肺腺癌干細胞樣細胞中表達高低與CD133+肺腺癌干細胞樣細胞放射敏感性之間的關系。
　　目的:探討miR-18a在肺腺癌干細胞樣細胞放射線抗拒中的作用及其調(diào)控機制，探索miR-18a作為

4、增敏放射線靶向殺傷腫瘤干細胞的分子靶點的可能性。
　　方法:1、利用紫杉醇及無血清干細胞培養(yǎng)基，誘導肺腺癌A549細胞的成球生長，獲得肺腺癌干細胞樣細胞，流式細胞儀分選出CD133+細胞繼續(xù)培養(yǎng);利用實時熒光定量聚合酶鏈反應(Real-time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chainreaction，qRT-PCR)、成球實驗、克隆形成實驗等對

5、CD133+細胞進行干細胞相關特性驗證;利用放射線照射CD133+及CD133-細胞，克隆形成實驗檢測克隆形成能力;qRT-PCR檢測CD133+及CD133-細胞中miR-18a表達水平;構建miR-18a慢病毒(Lentivirus，LV)過表達體系，并轉染CD133+細胞，分為miR-18a慢病毒轉染組(miR-18a-LV)、空載體轉染組(EV)及空白對照組(Blank)，qRT-PCR檢測轉染后細胞干性相關基因表達情況以及mi

6、R-18a表達情況，并檢驗轉染后細胞成球能力;傳代培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定傳代的miR-18a過表達CD133+細胞，不同劑量放射線照射轉染前后細胞，分為miR-18a-LV組、EV組及Blank組，進行克隆形成實驗，計算克隆形成數(shù)目及存活分數(shù)，描計細胞存活曲線并計算D0、 Dq、SF2等放射生物學參數(shù)。
　　2、利用網(wǎng)絡資源在線分析軟件，PicTar(http://pictar.mdc-berlin.de/cgi-bin/PicTar)，

7、TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_50/)和miRanda(http://www.microma.org/)等預測miR-18a的靶基因（乏氧誘導因子1，HIF-1α）;運用雙熒光素酶系統(tǒng)、qRT-PCR、Westen Blot等實驗，驗證miR-18a對HIF-1α的負調(diào)控作用;利用慢病毒載體建立miR-18a過表達A549細胞系，裸鼠移植瘤實驗，驗證miR-18a增強放射線對移植瘤的

8、殺傷效應;qRT-PCR、Western blot檢測移植瘤組織miR-18a、HIF-1α表達情況。
　　3、收集NSCLC患者放療前血漿樣本，qRT-PCR檢測患者放療前血漿中miR-18a表達情況，以Cel-39為外參照，分析miR-18a表達高低與患者放療療效之間的相關性，并通過ROC曲線計算miR-18a最佳分界值(cut-off);以miR-18a分界值為標準，分析miR-18a不同表達水平兩組NSCLC患者在放療反應

9、性即客觀緩解率(ORR)、無進展生存期(PFS)、總生存時間(OS)的差異，并計算miR-18a分界值預測放療療效的敏感性、特異性。
　　結果:1、無血清培養(yǎng)基成功誘導了克隆形成的肺腺癌細胞，流式細胞分選后獲得了CD133+的細胞群，干性相關實驗驗證顯示其具有干細胞特征;克隆形成實驗顯示CD133+細胞克隆形成能力高于CD133-細胞(P＜0.05);qRT-PCR實驗顯示CD133+細胞中miR-18a表達水平低于CD133-細

10、胞(P＜0.05);通過慢病毒表達體系，獲得了miR-18a穩(wěn)定過表達的CD133+細胞;放射線存活曲線顯示，miR-18a過表達可增強CD133+細胞放射線敏感性，D0、Dq、SF2等放射生物學參數(shù)均下降(P＜0.05)。
　　2、雙熒光素酶實驗顯示miR-18a與HIF-1α基因3'-UTR相結合，發(fā)揮直接調(diào)控作用;Westen Blot實驗結果顯示，miR-18a過表達，可阻斷A549細胞中HIF-1α蛋白表達量(P＜0.0

11、5);放射線照射可下調(diào)A549細胞miR-18a表達水平，同時上調(diào)HIF-1α基因和蛋白表達;裸鼠移植瘤實驗顯示，與對照組相比，miR-18a輻照組移植瘤的腫瘤體積小、生長速度慢(P＜0.05)，移植瘤中miR-18a表達較高，HIF-1α基因和蛋白表達較低。
　　3、54例NSCLC患者放療前血漿標本，qRT-PCR檢測顯示:放療有效組(CR+PR)血漿miR-18a水平顯著高于放療耐受組(SD+PD)組(P＜0.05);ROC

12、曲線顯示miR-18a/Cel-39最佳分界值為2.28;以miR-18a/cel-39＞2.28為參考值，miR-18a高表達組放療后ORR優(yōu)于miR-18a低表達組(87％ vs6％，P＜0.05)，中位PFS無統(tǒng)計學差異(8.1m vs6.5m，P＞0.05)，中位OS也無統(tǒng)計學差異(18.7m vs15.5m，P＞0.05);以miR-18a/cel-39＞2.28為參考值，預測放療療效的敏感性為87％、特異性為95％。