miR-18a對肺腺癌A549細胞放射增敏作用及分子機制研究.pdf

1、背景及目的:
　　肺癌是世界范圍內最常見的腫瘤。據統計,僅2008年就有161萬新增病例,其中約80％為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。雖然手術仍然是NSCLC的首選治療方法,但其確診時大多數已處于中晚期,只有少部分患者可以得到手術根治,約70%的NSCLC患者在整個治療過程中需要接受放療。然而,臨床上不少患者接受放療后出現復發(fā),最終導致患者死亡。究其原因,肺癌細胞對放射線抗拒起重

2、要作用。因此,深入研究放射耐受產生的機制,探尋潛在的干預靶點,對于提高放療的治療效果,改善肺癌預后具有重要意義。
　　現已明確,放化療耐受是腫瘤干細胞的特征之一。而其中具有廣泛基因調控作用的微小RNA(microRNA,miR)的變化及其意義,更是目前研究的熱點。本課題組前期研究發(fā)現,A549肺腺癌干細胞樣細胞與普通A549細胞相比,miR-18a水平降低。由此可以推測,miR-18a下調可能和肺腺癌細胞照射耐受有關,但其具體作用

3、機制并不明了。晚近研究表明,共濟失調-毛細血管擴張癥突變基因(Ataxia-telangiectasia mutated,ATM)在DNA損傷修復中起重要作用;而其3’非編碼區(qū)具有miR-18a結合位點。由此,我們可以進一步推測:miR-18a通過ATM調控DNA損傷修復,在肺腺癌A549細胞照射耐受中起重要作用。為驗證這一設想,本實驗擬先觀察A549細胞受X線照射后miR-18a的變化;然后通過轉染miR-18a模擬物,檢測其對A54

4、9細胞照射敏感性的影響;最后,檢測過表達miR-18a的A549細胞中ATM蛋白的改變,以初步闡明miR-18a在肺腺癌細胞照射耐受中調控作用的分子機制。
　　材料和方法:
　　1.X線照射對A549細胞miR-18a表達的影響:利用實時定量PCR(qRT-PCR)檢測A549細胞受2GyX線照射后miR-18a的變化。
　　2.miR-18a對A549細胞照射敏感性的影響:以人工合成的miR-18a模擬物(mimic

5、s)轉染肺腺癌A549細胞,獲得miR-18a高表達A549細胞。通過集落形成實驗,分別檢測miR-18a高表達A549細胞受0,2,4,6,8GyX線照射后的克隆形成能力,描記細胞存活曲線并計算放療敏感性指標(D0、Dq、SF2),判斷miR-18a對A549細胞照射敏感性的影響。
　　3.miR-18a影響A549細胞照射敏感性的機制:以Western Blot檢測過表達miR-18a的A549細胞中ATM蛋白的改變,初步闡明

6、miR-18a在肺腺癌細胞照射耐受中調控作用的分子機制。
　　結果:
　　1.A549細胞受2GyX線照射后,從0.5小時開始,miR-18a水平降低,直至照射后4小時miR-18a仍處于低水平。以0h組作為基線水平,0.5h、1h、2h和4h組miR-18a相對量分別為0.20±0.05,0.22±0.10,0.18±0.04和0.31±0.09。與0h組比較,差異均有統計學意義(P<0.05)。
　　2.miR-1

7、8a模擬物(mimics)成功轉染肺腺癌A549細胞,轉染后miR-18a水平增高,差異有統計學意義(P<0.05)。集落形成實驗顯示,miR-18a可以降低A549細胞2Gy時存活分數(SF2),差異有統計學意義(P<0.05)。擬合劑量-存活曲線顯示:miR-18a可以降低A549細胞的D0、Dq、SF2值。
　　3.半定量分析顯示,以空白對照組作為基線,過表達miR-18a組共濟失調-毛細血管擴張癥突變基因(Ataxia-t

8、elangiectasia mutated,ATM)蛋白及其活化形式磷酸化的ATM(phospho Ser1981)水平分別降至0.68±0.12和0.48±0.05(P<0.05)。
　　結論:
　　1.miR-18a水平降低,可能是A549細胞受X線照射后發(fā)生耐受的一個重要原因。
　　2.miR-18a主要通過下調在DNA損傷修復中起重要作用的ATM及其磷酸化活性形式ATM(phospho Ser1981)的表達,