姜黃素對肺腺癌A549細胞化療藥物的增敏效應及其機制研究.pdf

1、目的 姜黃素(curcumin)是從中藥姜黃屬植物姜黃的根莖中提取的一種酚性色素，能夠抑制多種腫瘤細胞的增殖并誘導腫瘤細胞凋亡，對正常組織器官無明顯毒副作用。順鉑為肺癌化療的常用藥物，姜黃素與順鉑聯(lián)用是否會增強順鉑對肺癌的殺傷效應?目前尚無這方面的研究報道。線粒體是真核細胞重要的細胞器，是細胞的能量工廠，在細胞的凋亡中也起著非常重要的作用。線粒體DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)是唯一的核外遺傳物質(zhì)，含有2個

2、rRNA基因、22種tRNA基因及線粒體氧化磷酸化所需的13種多肽基因，參與細胞氧化磷酸化和能量代謝，與細胞的存亡息息相關。本研究擬觀察姜黃素與順鉑聯(lián)合對肺癌細胞增殖的抑制作用，并深入研究mtDNA基因、核凋亡相關基因表達變化與兩藥聯(lián)合殺傷效應之間的相關性，目的在于尋找到有效的化療增敏劑，為提高肺癌的臨床療效、減少順鉑的用量、減輕化療的毒副反應提供實驗依據(jù)。 方法 采用MTT法觀察姜黃素、順鉑及兩者聯(lián)合對A549細胞的抑

3、制作用，姜黃素單藥設6個濃度組，分別為5、10、15、20、40、80μmol/L，順鉑設5個濃度組，分別為0.25、0.5、1、2、4μg/ml。兩藥聯(lián)合取順鉑的終濃度為1μg/ml、2μg/m1分別與姜黃素5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L聯(lián)合，同時設陰性對照組、空白對照組，培養(yǎng)24h、48h、72h后，觀察對A549細胞增殖的影響；以流式細胞技術結(jié)合PI及AnnexinV-FITC雙標染色觀察細胞

4、的凋亡情況；倒置顯微鏡、透射電鏡觀察細胞形態(tài)學的變化；提取未加藥、兩藥聯(lián)合作用6h、12h、18h、24h后A549細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄熒光標記，用人mtDNA基因表達譜芯片檢測靶基因的差異表達，GenPixPro芯片圖像分析軟件進行基因差異的統(tǒng)計學分析。 結(jié)果 1.姜黃素、順鉑兩單藥對人肺腺癌A549細胞增殖的抑制作用 姜黃素、順鉑這兩種單藥均能抑制A549細胞的增殖，隨著時間的延長，濃度的增加，對A549細胞

5、增殖的抑制作用增強，兩者作用于人肺腺癌A549細胞48h的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為18.40μmol/L、0.966μg/ml。 2.姜黃素與順鉑聯(lián)合對人肺腺癌A549細胞增殖的抑制作用 1μg/ml、2μg/ml順鉑與10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L姜黃素聯(lián)合作用A549細胞24h、48h、72h后的抑制率顯著高于單用順鉑、姜黃素組(P＜0.05)，兩者呈現(xiàn)出相加的抗瘤效果。 3.姜黃

6、素與順鉑聯(lián)合作用人肺腺癌A549細胞后細胞凋亡率的變化 流式細胞技術結(jié)合AnnexinV-FITC及PI雙標染色分析發(fā)現(xiàn)，未加藥、2μg/ml順鉑、15μmol/L姜黃素、2μg/ml順鉑與15μmol/L姜黃素聯(lián)合作用A549細胞24h后的凋亡率分別為0.18％、4.21％、3.45％、9.10％，從中可以看出凋亡率以兩藥聯(lián)合作用為最高。 4.姜黃素與順鉑聯(lián)合作用人肺腺癌A549細胞后細胞超微結(jié)構(gòu)的變化 透射電

7、鏡觀察顯示，2μg/ml順鉑與15μmol/L姜黃素聯(lián)合作用A549細胞24h，部分A549細胞的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了的改變，如線粒體腫脹，胞漿空泡化，此外還可見到部分細胞壞死。 5.姜黃素與順鉑聯(lián)合作用人肺腺癌A549細胞后細胞mtDNA基因及核凋亡基因的表達情況。 2μg/ml順鉑與15μmol/L姜黃素聯(lián)合作用A549細胞不同時間點mtDNA及凋亡相關基因的差異表達：6h，12SrRNA、ND5基因表達顯著上調(diào)，ND2、

8、ND3、tRNA-SER、p53、Bax基因表達有一定程度的上調(diào)；12h，Bax基因表達顯著上調(diào)，ND3基因表達有一定程度的上調(diào)，tRNA-SER基因表達有一定程度的下調(diào)；18h，Bax、Bcl-xL基因表達顯著上調(diào)，tRNA-CYS、ND3、COXI、ND1基因表達有一定程度上調(diào)；24h，Bcl-xL、16SrRNA、ATPase6、ATPase8基因表達顯著下調(diào)，ND5基因表達有一定程度的下調(diào)，Bax基因表達顯著上調(diào)，ND3基因表達

9、有一定程度的上調(diào)。 結(jié)論 1.姜黃素、順鉑對人肺腺癌A549細胞的增殖有明顯的抑制作用，姜黃素能夠增強順鉑的抗腫瘤效果。 2.姜黃素、順鉑能夠誘導人肺腺癌A549細胞凋亡，兩者聯(lián)合誘導A549細凋亡效應更強，具體作用機制在于姜黃素能誘導A549細胞Bax基因表達上調(diào)，Bcl-xL基因表達下調(diào)，使Bax/Bcl-xL比值顯著上升。 3.姜黃素與順鉑聯(lián)合作用于A549細胞后的初期階段(18h內(nèi))，mtDNA部