匹羅卡品致癇小鼠海馬神經(jīng)元線(xiàn)粒體移動(dòng)變化研究.pdf

1、目前全世界約有5000萬(wàn)人患有癲癇，它是臨床上最常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一。由于長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作，并且嚴(yán)重降低患者的生活質(zhì)量，因此探索癲癇的發(fā)病機(jī)制和積極尋找新的治療靶點(diǎn)具有重要意義。線(xiàn)粒體的功能在癲癇的影響下會(huì)發(fā)生紊亂，線(xiàn)粒體損傷促使呼吸鏈中活性氧增多，線(xiàn)粒體的DNA發(fā)生突變，巰基發(fā)生氧化，蛋白質(zhì)交聯(lián)。DNA的甲基化功能下降，最后引起一系列的病理改變，如組蛋白乙?；霈F(xiàn)異常以及生物膜脂質(zhì)被過(guò)度氧化，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)堆積大量變性蛋白和受損細(xì)胞器。

2、膜電位在線(xiàn)粒體受到損傷時(shí)下降明顯，伴隨著線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)增加，細(xì)胞色素C(Cyt c)和凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)被釋放到細(xì)胞質(zhì)中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡促使神經(jīng)元對(duì)于癲癇損傷更加敏感，這形成惡性循環(huán)。所以，對(duì)受損的線(xiàn)粒體進(jìn)行及時(shí)的清除非常關(guān)鍵。
　　線(xiàn)粒體移動(dòng)在維持線(xiàn)粒體功能穩(wěn)定和清除受損線(xiàn)粒體方面發(fā)揮了非常重要的作用。線(xiàn)粒體移動(dòng)可將受損線(xiàn)粒體逆行轉(zhuǎn)運(yùn)至胞體被降解和回收，同時(shí)將正常線(xiàn)粒體順向運(yùn)動(dòng)至神經(jīng)元的作用部位而發(fā)揮功能。線(xiàn)粒體功能

3、正常情況下，線(xiàn)粒體通過(guò)移動(dòng)來(lái)使得其分布正常，而且不僅如此，其還能夠?qū)⒕€(xiàn)粒體移動(dòng)到合適的位置來(lái)應(yīng)對(duì)其損傷。
　　目前為止，針對(duì)線(xiàn)粒體移動(dòng)的具體機(jī)制還不是完全清楚。Miro屬于小GTPase家族成員，與線(xiàn)粒體的移動(dòng)密切相關(guān)。研究表明，Miro與Milton可在神經(jīng)細(xì)胞中形成復(fù)合物并與肌球蛋白重鏈(KHC)相連接，以此來(lái)控制微管內(nèi)線(xiàn)粒體的移動(dòng)。線(xiàn)粒體的轉(zhuǎn)運(yùn)在miro1突變時(shí)會(huì)受到抑制，使線(xiàn)粒體聚集形成為絲狀線(xiàn)粒體。此外，還有研究顯示，在

4、H9c2細(xì)胞及原代腦皮層神經(jīng)細(xì)胞中，Miro表達(dá)量的多少影響線(xiàn)粒體移動(dòng)的活力。目前在癲癇發(fā)作后神經(jīng)元線(xiàn)粒體損傷中線(xiàn)粒體移動(dòng)異常發(fā)揮何種作用還不清楚，然而，其能否通過(guò)控制線(xiàn)粒體的移動(dòng)來(lái)影響神經(jīng)對(duì)其的保護(hù)作用，這點(diǎn)還有待研究。
　　目的:
　　本課題通過(guò)觀察匹羅卡品致癇小鼠海馬線(xiàn)粒體移動(dòng)相關(guān)蛋白Miro1表達(dá)水平變化，探討線(xiàn)粒體移動(dòng)在癲癇神經(jīng)元損傷中的作用，同時(shí)構(gòu)建腺病毒真核表達(dá)質(zhì)粒提高M(jìn)iro1表達(dá)，觀察致癇小鼠行為學(xué)、神經(jīng)細(xì)

5、胞凋亡，海馬神經(jīng)元缺失的變化情況，以及檢測(cè)氧化應(yīng)激相關(guān)生理及分子指標(biāo)MDA，Mn-SOD，GSH-Px和ND6變化情況，并通過(guò)檢測(cè)凋亡相關(guān)物質(zhì)Bax，Bcl-2，Bcl-xL，細(xì)胞色素c，caspase-3和caspase-9等表達(dá)水平變化，探討癲癇發(fā)作后神經(jīng)元損傷的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。
　　方法:
　　48只成年健康雄性的C57BL/6小鼠，體重在18-25g，隨機(jī)分成四組:正常組（正常小鼠）、致癇組（癲癇小鼠）、對(duì)照腺病毒組（

6、癲癇小鼠注射對(duì)照空載腺病毒）及Miro1過(guò)表達(dá)腺病毒組（癲癇小鼠注射Mrio1過(guò)表達(dá)重組腺病毒）。后兩組小鼠腹腔注射10％水合氯醛麻醉（0.004ml/g），用腦立體定位儀取平顱位固定小鼠。剃去小鼠顱頂毛發(fā)，用75％的酒精消毒顱頂皮膚后，皮膚開(kāi)口約1cm。再用碘伏消毒，顯出顱骨骨縫。定位AP=-0.3mm; ML=-1.0mm; DV=-2.0mm，注射2μl Miro1過(guò)表達(dá)重組腺病毒或者對(duì)照腺病毒載體，20min內(nèi)緩慢注射完畢，注射

7、后留針10min，將針尖移出，消毒后用骨蠟填塞骨孔，縫合皮膚。上述24h后后三組小鼠皮下注射1mg/kg的東莨菪堿，30min后腹腔注射匹羅卡品(340mg/kg)誘導(dǎo)癲癇持續(xù)狀態(tài)。小鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)持續(xù)發(fā)作90min時(shí)，腹腔注射地西泮(6mg/kg)終止癲癇發(fā)作。小鼠癲癇模型制作成功標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)Racine癇性發(fā)作分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定，造模成功后分別記錄小鼠的致癇成功率及潛伏期。小鼠在癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)作24h時(shí)，被麻醉斷頭取腦，并迅速分離出雙側(cè)海

8、馬，臨死前進(jìn)行腦電圖描記。Real-Time PCR法檢測(cè)Miro1 mRNA表達(dá)水平。檢測(cè)氧化應(yīng)激相關(guān)生理指標(biāo)MDA，Mn-SOD及GSH-Px，并使用Western blot檢測(cè)小鼠海馬Miro1、ND6、Bax、Bcl-2、Bcl-xL、細(xì)胞色素c、caspase-3和caspase-9等表達(dá)水平。剩余小鼠在癲癇持續(xù)狀態(tài)后72h時(shí)麻醉后灌注取腦，采用尼氏染色法檢測(cè)癲癇小鼠海馬神經(jīng)元損傷，并且采用TUNEL法檢測(cè)小鼠海馬神經(jīng)元凋亡情

9、況。
　　以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)來(lái)表示所有研究數(shù)據(jù)資料，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行。致癇成功率采用卡方檢驗(yàn)(Chi-Square Tests)比較，其余采用單因素方差分析方法(ANOVA)進(jìn)行組間比較，兩組間比較采用LSD(Least-SignificantDifference)-t檢驗(yàn)，顯著性水平為α=0.05。
　　結(jié)果:
　　1.致癇小鼠行為學(xué)觀察及腦電圖結(jié)果
　　正常組小鼠行為及腦電圖均

10、正常。按照Racine癇性發(fā)作分級(jí)，在腹腔注射匹羅卡品后，癲癇組、對(duì)照腺病毒組及Miro1過(guò)表達(dá)腺病毒組三組小鼠癇性發(fā)作級(jí)別可達(dá)到Ⅳ-Ⅴ級(jí)并出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)，癲癇模型造模成功率以及癇性發(fā)作潛伏期在上述三組小鼠之間均無(wú)顯著性差異(p＞0.05);三組小鼠在腹腔注射匹羅卡品后腦電圖可以描記到多量的高幅的棘波、尖波及其棘（尖）慢綜合波。
　　2.病理學(xué)觀察
　　2.1 Nissl染色結(jié)果:
　　SE發(fā)作后72h時(shí)與正常組相比

11、，癲癇組、對(duì)照腺病毒組及Miro1過(guò)表達(dá)腺病毒組三組小鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元有明顯缺失，神經(jīng)元計(jì)數(shù)明顯減少，統(tǒng)計(jì)有顯著性差異(p＜0.05);SE后72h時(shí)與對(duì)照腺病毒組相比，Miro1過(guò)表達(dá)腺病毒組小鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元計(jì)數(shù)明顯增多，統(tǒng)計(jì)有顯著性差異(p＜0.05)。
　　2.2 TUNEL法結(jié)果:
　　SE發(fā)作后72h時(shí)與正常組相比，癲癇組、對(duì)照腺病毒組及Miro1過(guò)表達(dá)腺病毒組三組小鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元凋亡明顯增多，有顯

12、著性差異(p＜0.05)。SE后72h時(shí)與對(duì)照腺病毒組相比，Miro1過(guò)表達(dá)腺病毒組小鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元凋亡數(shù)目減少，有顯著性差異(p＜0.05)。
　　3.線(xiàn)粒體移動(dòng)相關(guān)蛋白Miro1表達(dá)檢測(cè):
　　3.1 mRNA水平
　　相比于正常組，癲癇能夠顯著抑制小鼠海馬組織中Miro1 mRNA水平的表達(dá)(p＜0.05)，注射Miro1過(guò)表達(dá)重組腺病毒能夠有效上調(diào)小鼠海馬組織中Miro1的mRNA表達(dá)水平(p＜0.05)

13、。
　　3.2 蛋白水平
　　相比于正常組，癲癇能夠顯著抑制小鼠海馬組織中Miro1蛋白水平的表達(dá)(p＜0.05)，注射Miro1過(guò)表達(dá)重組腺病毒能夠有效上調(diào)小鼠海馬組織中Miro1的蛋白表達(dá)水平(p＜0.05)。
　　4.氧化應(yīng)激相關(guān)生理及分子指標(biāo)檢測(cè)
　　相比于正常組，癲癇能夠顯著抑制小鼠海馬組織中Mn-SOD及GSH-Px的活性，上調(diào)MDA的水平，而注射Miro1過(guò)表達(dá)重組腺病毒能夠有效抑制癲癇誘導(dǎo)的MDA

14、積累，同時(shí)上調(diào)海馬組織中Mn-SOD及GSH-Px的活性(p＜0.05)。相比于正常組，癲癇能夠顯著抑制小鼠海馬組織中ND6的表達(dá)，而注射Miro1過(guò)表達(dá)重組腺病毒能夠有效提高海馬組織中ND6的水平(p＜0.05)。
　　5.凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)
　　數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，相比于正常組，癲癇能夠顯著抑制小鼠海馬組織中抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bcl-xL的表達(dá)水平，誘導(dǎo)促凋亡蛋白Bax以及caspase-3、caspase-9的表達(dá)

15、活化，胞漿中CytC含量升高，線(xiàn)粒體中CytC含量下降。Miro1過(guò)表達(dá)重組腺病毒注射能夠逆轉(zhuǎn)癲癇誘導(dǎo)的小鼠海馬組織中上述指標(biāo)的變化。
　　結(jié)論:
　　1.癲癇模型小鼠海馬組織中Miro1 mRNA以及蛋白的表達(dá)水平均低于正常小鼠，這說(shuō)明線(xiàn)粒體移動(dòng)的變化是參與了癲癇病理?yè)p傷過(guò)程的。Miro1過(guò)表達(dá)重組腺病毒注射能夠一定程度上恢復(fù)海馬組織中Miro1的表達(dá)。
　　2.癲癇能夠誘導(dǎo)小鼠海馬組織線(xiàn)粒體損傷以及氧化應(yīng)激的發(fā)生，

16、Miro1過(guò)表達(dá)重組腺病毒注射能夠降低癲癇模型小鼠海馬組織中線(xiàn)粒體損傷以及氧化應(yīng)激程度。
　　3.癲癇能夠誘導(dǎo)小鼠海馬組織線(xiàn)粒體途徑細(xì)胞凋亡的發(fā)生，Miro1過(guò)表達(dá)重組腺病毒注射能夠抑制癲癇模型小鼠海馬組織中的細(xì)胞凋亡。
　　4.提高線(xiàn)粒體移動(dòng)相關(guān)蛋白Miro1表達(dá)，可以通過(guò)降低致癇小鼠海馬組織中線(xiàn)粒體損傷以及氧化應(yīng)激程度并抑制海馬神經(jīng)元凋亡而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，這有可能成為癲癇發(fā)作后神經(jīng)損傷新的神經(jīng)保護(hù)治療靶點(diǎn)。提高線(xiàn)粒體移