正常獼猴玻璃體腔注射人源黑視蛋白腺相關(guān)病毒表達及安全性研究.pdf

1、目的:
　　首先通過人源黑視蛋白腺相關(guān)病毒(pAAV2/8-CMV-hMel-p2A-YFP)轉(zhuǎn)染離體培養(yǎng)的293T細胞、正常大鼠原代視網(wǎng)膜節(jié)細胞、正常大鼠視網(wǎng)膜，驗證構(gòu)建的病毒載體轉(zhuǎn)染及表達性能。進一步通過對獼猴行兩種術(shù)式(1.直接玻璃體腔注射;2.內(nèi)界膜剝除+玻璃體腔注射)病毒注射，觀察該病毒在靈長類動物體內(nèi)的轉(zhuǎn)染及表達，并對比兩種術(shù)式對病毒表達的影響;探索正常獼猴視網(wǎng)膜節(jié)細胞表達人源黑視蛋白的對光反應(yīng)功能;觀察手術(shù)方式及病毒

2、在獼猴體內(nèi)轉(zhuǎn)染的安全性。為該光遺傳治療策略在治療人視網(wǎng)膜變性疾病提供理論基礎(chǔ)和實踐指導(dǎo)。
　　方法:
　　1.將構(gòu)建的共表達人源黑視蛋白及YFP熒光蛋白的腺相關(guān)病毒，通過體外轉(zhuǎn)染離體細胞(293T細胞系，正常大鼠原代視網(wǎng)膜節(jié)細胞)及在體轉(zhuǎn)染正常大鼠視網(wǎng)膜觀察人源黑視蛋白及YFP的表達，驗證該病毒的轉(zhuǎn)染、表達能力。
　　2.將3只正常獼猴的6眼分為兩組，3只右眼為一組，行后段玻璃體切除+內(nèi)界膜剝除+C3F8氣體填充+玻璃

3、體腔注射30μL構(gòu)建的腺相關(guān)病毒(病毒滴度9.71×1012v.p/mL);3只左眼為一組，直接玻璃體腔注射30μL病毒，注射病毒3個月后腹腔注射戊巴比妥鈉將獼猴安樂死，取下視網(wǎng)膜計數(shù)獼猴視網(wǎng)膜YFP陽性細胞，對比內(nèi)界膜剝除對病毒轉(zhuǎn)染效率的影響，并采用全細胞膜片鉗技術(shù)記錄YFP陽性細胞的對光反應(yīng)功能。
　　3.術(shù)前及術(shù)后1月、2月、3月對獼猴行眼底照相、自發(fā)熒光、OCT等眼部形態(tài)學(xué)檢測;術(shù)前及術(shù)后3月對獼猴的FERG、FVEP指標(biāo)

4、進行檢測，并行統(tǒng)計學(xué)分析，觀察病毒的注射及手術(shù)的處理是否會引發(fā)嚴重的眼部并發(fā)癥。
　　4.術(shù)前及術(shù)后3個月對獼猴外周血中炎癥因子、肝功能、腎功能等血液檢驗學(xué)指標(biāo)進行檢測，并行統(tǒng)計學(xué)分析，研究我們所使用的腺相關(guān)病毒是否會引起正常獼猴全身嚴重的免疫、炎癥反應(yīng)。
　　5.術(shù)后3個月腹腔注射戊巴比妥鈉將獼猴安樂死，對心臟、肝臟、腎臟等全身臟器行組織病理學(xué)觀察，研究我們所使用的腺相關(guān)病毒是否會引起基因突變，導(dǎo)致腫瘤等疾病的發(fā)生。

5、>　　結(jié)果:
　　1.構(gòu)建的人源黑視蛋白腺相關(guān)病毒在體外細胞系(293T細胞系、原代神經(jīng)元)及正常嚙齒類動物(LE大鼠)視網(wǎng)膜均有較好的轉(zhuǎn)染力，可共表達人源黑視蛋白及YFP熒光蛋白。
　　2.構(gòu)建的人源黑視蛋白腺相關(guān)病毒在正常獼猴視網(wǎng)膜有較好的轉(zhuǎn)染力，YFP熒光蛋白主要表達于節(jié)細胞，視網(wǎng)膜鋪片可見YFP陽性細胞的分布均為周邊高，中央低，內(nèi)界膜剝除眼和直接玻璃體腔注射眼之間未見統(tǒng)計學(xué)差異。
　　3.全細胞膜片鉗技術(shù)記錄到

6、470nm藍光刺激時，獼猴視網(wǎng)膜YFP陽性神經(jīng)節(jié)細胞能夠?qū)夥磻?yīng)，產(chǎn)生內(nèi)向電流及動作電位。
　　4.術(shù)前及術(shù)后1月、2月、3月眼底照相、眼底自發(fā)熒光、OCT等形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果表明:內(nèi)界膜剝除眼術(shù)后可見內(nèi)界膜剝除證據(jù)，未見手術(shù)并發(fā)癥，眼部功能學(xué)檢測(FERG，F(xiàn)VEP)術(shù)前及術(shù)后3個月比較無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　5.血液檢驗學(xué)指標(biāo)結(jié)果表明:獼猴肝功能、腎功能、心肌酶譜、炎性因子等指標(biāo)術(shù)前及術(shù)后3月對比未見統(tǒng)計學(xué)差異。
　　6.

7、全身各臟器石蠟切片HE染色未見明顯病理學(xué)改變。
　　結(jié)論:
　　1.證實了構(gòu)建的人源黑視蛋白腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染及表達能力正常，可共表達人源黑視蛋白及YFP熒光蛋白。
　　2.證明了在正常獼猴非感光視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞能夠通過光遺傳學(xué)技術(shù)表達人源黑視蛋白，獲得對光反應(yīng)功能。
　　3.建立了獼猴后段玻璃體切除+內(nèi)界膜剝除+C3F8氣體填充+玻璃體腔注射病毒的手術(shù)方式，研究了正常獼猴玻璃體腔注射和內(nèi)界膜剝除+玻璃體腔注射兩種轉(zhuǎn)