血清中長鏈非編碼RNA檢測方法的建立及其在結直腸癌診斷中的應用.pdf

1、結直腸癌是我國乃至全球最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅人們的身心健康。雖然早期結直腸癌患者治愈率高，5年生存率可達90％，但由于目前缺乏有效的早期診斷方法，大多數(shù)結直腸癌患者確診時已為中晚期，其生存率僅為10％～15％。結直腸癌的發(fā)生是一個復雜而緩慢的過程，多數(shù)認為由腺瘤或者鋸齒狀息肉到早期癌再到進展期癌。其演變過程涉及復雜的基因和蛋白表達變化。糖鏈抗原(carbohydrate antigen CA)、癌胚抗原(carcinoembry

2、onic antigen，CEA)等一些表達變化的分子能有效的篩查中晚期結腸癌，但對于早期結直腸癌的診斷率較低。因此，篩查并驗證結直腸癌相關基因及蛋白的表達譜有利于提高早期結直腸癌的診斷率，從而提高患者治愈率并延長生存時間。
　　長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一類長度為200～100，000 nt且不編碼蛋白的單鏈RNA分子。近年來，大量研究表明腫瘤的復發(fā)、轉移及患者的預后均與lncRNA

3、s的表達失調密切相關，其表達譜可能作為診斷惡性腫瘤的一類新的生物標志物，如HOTAIR、ncRuPAR等。文獻報道，在結直腸癌組織中多條lncRNAs表達上調，且與患者不良預后密切相關，如CCAT1、HOTAIR、H19等。最新的研究表明血清中l(wèi)ncRNAs可作為一種有效的非侵襲性的生物標志物診斷腫瘤，但在結直腸癌患者血清中l(wèi)ncRNAs的表達譜及其檢測方法極少研究。因此，本研究擬以lncRNAHOTAIR為例，建立血清中l(wèi)ncRNA的

4、檢測方法，進一步采用lncRNA芯片篩選結直腸癌組織中表達差異顯著的lncRNAs，并采用qRT-PCR驗證候選lncRNAs在結直腸癌組織及患者血清中的表達，采用工作特征曲線(ROC)分析lncRNAs的表達譜在結直腸癌診斷中的應用價值。
　　目的:建立血清中l(wèi)ncRNA的檢測方法，評價表達差異的lncRNA在結直腸癌診斷中的應用。
　　方法:1.采用lncRNA芯片篩選結腸直癌組織中表達差異的lncRNAs。
　　

5、采用lncRNA芯片技術篩查3對結直腸癌及癌旁組織中表達差異的lncRNAs，按照一定的篩選原則，候選7條lncRNAs，以及文獻報道在結直腸癌組織中高表達的3條lncRNAs，共計10條lncRNAs作為研究對象。
　　2.采用qRT-PCR驗證表達差異的lncRNAs。
　　2.1采用TRIzol及TRIzol LS法共提取25對結直腸癌及癌旁組織樣本與67例結腸癌患者、50例正常志愿者血清樣本中的總RNAs。
　

6、　2.2采用qRT-PCR相對定量法檢測已報道在結直腸癌中高表達的HOTAIR及候選的9條lncRNA的表達情況:采用PrimeScript結RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑（大連TaKaRa公司）對總RNA進行逆轉錄。采用SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑（大連TaKaRa公司）對合成的cDNA進行擴增。組織中以β-actin為內參，血清中引入線蟲的microRNA(Cel-miR-39)作為

7、內參。
　　2.3.ROC分析lncRNAs表達譜在結直腸癌診斷中的準確率。
　　2.4采用Pearson做lncRNAs表達譜與結直腸癌TNM分期、淋巴結轉移及CA19-9值的相關性分析。
　　結果:1.成功建立血清中l(wèi)ncRNAs(LINC01608、LINC00594、RP11-91J3.3、H19及HOTAIR)的檢測方法。
　　2.HOTAIR在結直腸癌組織及患者血清中高表達，且與患者淋巴結轉移相關。1

8、0例配對結直腸癌及癌旁組織樣本中，HOTAIR在8例癌組織中的表達高于配對癌旁組織，兩者間差異有統(tǒng)計學意義;在47例結直腸癌患者及40例正常志愿者血清樣本中，結直腸癌患者血清中HOTAIR的表達高于正常志愿者，兩者間差異有統(tǒng)計學意義。TNMⅢ/Ⅳ期的結直腸癌患者血清中HOTAIR的表達高于正常志愿者，Ⅲ/Ⅳ期高于Ⅰ/Ⅱ期;淋巴結轉移及非轉移的結直腸癌患者血清中HOTAIR的表達均高于正常志愿者，且淋巴結轉移患者高于非轉移患者;ROC分析

9、提示HOTAIR可能作為結直腸癌診斷的有效標志物。
　　3.在結直腸癌組織中篩選表達差異顯著的lncRNAs。由lncRNA基因芯片篩選出P＜0.01，lncRNA長度小于1000bp，高表達倍數(shù)＞5，且排前7位的lncRNAs，即:LINC01608、XIST、LINC00594、RP11-91J3.3、SEMA3B-AS1、RP11-396O20.2和RP11-867G23.13,加之文獻已報道在結直腸癌組織中高表達的2條ln

10、cRNAs: CCAT1和H19共計9條lncRNAs。
　　4.LINC00594和RP11-91J3.3在結直腸癌患者血清中顯著高表達。在25例配對結直腸癌及癌旁組織樣本中，LINC01608、LINC00594、RP11-91J3.3和H19的表達在兩者間差異無統(tǒng)計學意義;在67例結直腸癌患者及50例正常志愿者血清樣本中，LINC00594和RP11-91J3.3在結直腸癌患者血清中的表達高于正常志愿者，兩者間差異有統(tǒng)計學意