不同藥物干預心、腎缺血再灌注損傷的作用與機制研究.pdf

1、缺血所引起的重要功能器官損傷是致死性疾病的主要原因，諸如心肌梗死、腦卒中、肝腎衰竭等。通過治療手段使血液灌注恢復后，缺血器官功能代謝障礙及結(jié)構(gòu)破壞不但未減輕反而加重的現(xiàn)象稱為缺血再灌注損傷（Ischemia-reperfusion injury，I/R）。長期以來，缺血再灌注損傷一直是臨床治療的難點和熱點，但近年來臨床治療方法一直沒有明顯進步。我們在實驗室前期研究的基礎上，建立了心、腎缺血再灌注損傷動物和細胞模型，觀察了骨骼肌分泌的小分

2、子代謝調(diào)節(jié)功能蛋白——鳶尾素(Irisin)、直接腎素抑制劑——阿利吉侖(Aliskiren)、D2類多巴胺受體D3亞型激動劑——PD128907對于缺血再灌注損傷的治療作用，從不同的切入點探討了氧化應激的調(diào)節(jié)與I/R損傷治療的關系，研究結(jié)果可能促進缺血再灌注損傷治療的相關理論研究。具體分三部分闡述。
　　第一部分 鳶尾素對心肌缺血再灌注損傷的作用和機制研究
　　目的:
　　揭示肌源性因子——鳶尾素對急性心肌缺血/再灌

3、注損傷保護作用及機制。
　　方法:
　　1.在體研究，采用缺血45min再灌注24h誘導大鼠心肌急性缺血/再灌注損傷模型。鳶尾素在再灌注前即刻給予，以評估心肌保護作用。大鼠處死前，超聲測定觀察心臟的結(jié)構(gòu)和功能;處死后留取血液樣本檢測心肌損傷標志物，以迸一步確定心肌保護作用。TTC染色觀察心肌梗死面積;TUNEL法評價組織的細胞凋亡率;心臟標本留取用于檢查細胞凋亡和氧化應激水平，以觀察鳶尾素預處理對心肌壞死、凋亡、氧化應激的影

4、響，以探索其可能機制。
　　2.體外研究，以H9c2細胞為觀察對象。細胞培養(yǎng)上清液中LDH釋放水平和細胞存活率被用來評估鳶尾素預處理對細胞缺氧/復氧損傷模型的保護作用。免疫熒光染色觀察亞細胞細胞器中鳶尾素的定位;DCFH-DA熒光探針用于檢測細胞內(nèi)ROS的生成水平;測量線粒體膜電位以評估線粒體功能;應用免疫印跡法檢測超氧化物歧化酶家族和鳶尾素的共定位及表達;用透射電子顯微鏡觀察亞細胞器超微結(jié)構(gòu)的變化，以探討鳶尾素保護作用的可能機制

5、。
　　3.采用大鼠左股動脈無創(chuàng)動脈夾夾閉5min，開放5min，5個循環(huán)的方法進行遠隔缺血預適應處理。免疫印跡法和ELISA方法檢測遠隔缺血預適應刺激后血清鳶尾素濃度。通過免疫組化染色確定心肌組織中鳶尾素的分布。
　　結(jié)果:
　　1.RIPC恢復了I/R損傷后血清鳶尾素的濃度并增高了鳶尾素在心肌組織損傷區(qū)的表達。
　　2.動物模型研究顯示，靜脈注射外源性鳶尾素可以劑量依賴性的減少心肌缺血再灌注損傷模型的心肌梗死

6、面積，下調(diào)心肌損傷標志物肌鈣蛋白Ⅰ(cTnⅠ)和肌酸激酶(CK)的血清水平，降低乳酸脫氫酶(LDH)活性，與溶劑對照I/R組相比差異顯著(P＜0.05)。鳶尾素也改善了心功能，恢復了I/R組大鼠左室射血分數(shù)(LVEF)，與溶劑對照I/R組相比差異顯著(P＜0.05)。給藥前對鳶尾素進行高溫處理或者用抗體(抗體∶鳶尾素=5∶1)中和可以消除鳶尾素的心肌保護作用。鳶尾素治療I/R組，心肌細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導通路關鍵蛋白（casepase3和Ba

7、x）的表達和活性，以及氧化應激指標(MDA，MPO)都顯著降低，而抗凋亡蛋白(Bcl-2)的表達和超氧化物歧化酶(SOD)的活性都明顯恢復，與溶劑對照I/R組相比差異顯著(P＜0.05)。
　　3.鳶尾素預處理呈劑量依賴性預防無氧/復氧損傷誘導的細胞死亡，保護細胞的完整性，并抑制細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。鳶尾素處理促進了和線粒體SOD2的共定位，升高線粒體膜電位，改善線粒體功能。電子顯微鏡觀察表明，鳶尾素可以增加細胞中的線粒體數(shù)量，減輕

8、無氧/復氧損傷引起的線粒體超微結(jié)構(gòu)破壞。
　　結(jié)論:
　　1.骨骼肌分泌的功能小分子蛋白——鳶尾素具有心肌保護作用。
　　2.其主要保護機制可能與鳶尾素通過向線粒體轉(zhuǎn)位，抑制線粒體SOD2降解，減少氧化應激，抑制Bax凋亡蛋白表達，抑制凋亡通路關鍵激酶Caspase3的活性，減少心肌細胞凋亡，可能是鳶尾素心肌保護的主要機制。
　　3.肢體遠隔缺血預適應(RIPC)可以誘導循環(huán)中鳶尾素含量增加，血漿鳶尾素可向受損心

9、肌轉(zhuǎn)移，鳶尾素可能是介導骨骼肌遠端缺血預適應保護的重要內(nèi)源性媒介之一。提示鳶尾素可能是應激條件下參與病理性氧化應激再平衡的重要內(nèi)源性因素。
　　第二部分 阿利吉侖對大鼠腎缺血再灌注損傷的保護作用
　　目的:
　　評估直接腎素抑制劑——阿利吉侖在急性腎缺血/再灌注損傷模型中的作用和探討可能的機制。
　　方法:
　　通過構(gòu)建單一左腎缺血45min/再灌注24h的大鼠腎缺血再灌注損傷模型，觀察阿利吉侖預處理（缺血

10、前15min）對腎功能、病理變化、血漿血管緊張素Ⅱ水平、細胞凋亡、氧化應激水平和炎癥的影響，以評估其腎I/R損傷保護作用及與凋亡、氧化應激、炎癥的關系。
　　結(jié)果:
　　與假手術(shù)組相比，血清肌酐(Scr)、血尿素氮（BUN）在I/R大鼠顯著增加，伴有腎組織病理學損傷，包括腎小管上皮細胞腫脹、脫落和栓塞的形成，證明單腎缺血再灌注損傷模型構(gòu)建成功。與假手術(shù)組大鼠相比，I/R組有更多的凋亡細胞和白細胞浸潤。阿利吉侖預處理減輕了I/

11、R損傷誘導的腎損傷，降低血清肌酐和尿素氮水平，改善腎組織學病理變化，降低腎小管細胞凋亡和白細胞浸潤，降低了血漿血管緊張素Ⅱ水平。I/R損傷也減少了超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽（還原型GSH）的水平，可被阿利吉侖預處理逆轉(zhuǎn)。
　　結(jié)論:
　　1.直接腎素轉(zhuǎn)化酶抑制劑——阿利吉侖(Aliskiren)的預防性應用可以有效拮抗大鼠腎缺血再灌注損傷，并減少腎臟上皮細胞的壞死和凋亡，保護了靶器官功能，減輕了繼發(fā)炎癥反應。其機制可

12、能與抑制局部和全身RAS系統(tǒng)激活，降低AngⅡ合成，抑制氧化應激反應有關。
　　第三部分 多巴胺D3受體激活促進與Gα12連接上調(diào)減輕腎缺血/再灌注損傷
　　目的:
　　研究多巴胺受體D3R激動劑PD128907誘導的多巴胺受體D3R和G蛋白α12亞基之間的交互作用對急性腎缺血/再灌注損傷和NRK-52E細胞缺氧復氧損傷的作用和機制。
　　方法:
　　1.在體研究，動物模型構(gòu)建方法同第二部分。多巴胺受體D3

13、R激動劑PD128907（0.2 mg/kg，iv），或溶劑對照，在誘導缺血（或缺氧）前15分鐘給藥。收集血液和腎臟標本檢查腎功能，細胞凋亡和氧化應激水平，以及多巴胺受體D3R和G蛋白α12亞基之間的共連接水平。
　　2.體外研究，通過檢測G蛋白α12亞基過表達的NRK52E細胞的細胞生存率和培養(yǎng)上清液中LDH釋放水平來評價PD128907預處理對H/R損傷的影響。
　　結(jié)果:
　　1.多巴胺受體D3R激動劑PD128

14、907預處理可減輕大鼠單腎缺血再灌注損傷。PD128907預處理能增加腎谷胱甘肽和超氧化物歧化酶的水平;降低MDA水平;使促炎因子TNF-α和IL-1β下調(diào)，抗炎因子IL-10β上調(diào)，髓質(zhì)過氧化物酶活性降低;與此結(jié)果平行，腎小管上皮細胞凋亡的生物標志物的表達和活性都下調(diào)。
　　2.PD128907預處理還促進了I/R損傷后多巴胺受體D3R和G蛋白α12亞基之間的共連接水平增加。
　　3.細胞模型的研究表明，NRK-52E細胞

15、過表達G蛋白α12亞基減弱了PD128907對H/R損傷的保護作用。
　　結(jié)論:
　　1.多巴胺受體D3亞型激動劑PD128907的預防性應用同樣可以降低大鼠腎缺血再灌注損傷模型，相應減少腎臟上皮細胞的壞死和凋亡，減輕了繼發(fā)炎癥反應，改善遠期生存率。該結(jié)果在NRK-52E細胞缺氧復氧損傷模型中也得到驗證。
　　2.其機制可能與錨定傳遞胞外氧化應激損傷信號的重要G蛋白亞基Gα12，阻斷損傷性氧化應激信號傳遞，減輕局部和細