肝素減輕中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)誘導的內(nèi)皮細胞損傷.pdf

1、目的：
　　NETs是由中性粒細胞受到病原體、細胞因子以及化學物質刺激后核內(nèi)組分釋放到細胞外形成的一種網(wǎng)狀纖維結構，具有限制病原體擴散，分泌殺菌蛋白殺滅病原體等多種有益作用。過量的NETs可誘導內(nèi)皮細胞的損傷，從而在膿毒癥的發(fā)病機制中占有重要的地位。肝素具有抗凝及抗炎作用，能夠減輕膿毒癥內(nèi)皮細胞損傷及改善膿毒癥患者的預后。但肝素能否通過NETs的途徑發(fā)揮內(nèi)皮細胞保護作用尚不得而知。本研究通過PMA刺激PMN提取NETs，誘導體外培

2、養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞，進一步明確NETs對內(nèi)皮細胞的損傷作用，同時探討肝素能否減輕NETs誘導的內(nèi)皮細胞損傷，發(fā)揮對內(nèi)皮細胞的保護作用。
　　方法：
　　從健康志愿者中提取外周血，利用Percoll-Histopaque密度梯度離心法提取PMN，應用佛波酯(PMA)刺激PMN產(chǎn)生NETs，采用免疫熒光染色聯(lián)合熒光酶標儀檢測對NETs定性及定量。提取到的NETs吹打均勻，取等量的樣本誘導體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞，并分別加入D

3、Nase拮抗及肝素干預，37℃孵育6h，應用MTT法測定各組臍靜脈內(nèi)皮細胞的活性，評估內(nèi)皮細胞的損傷程度以及肝素對內(nèi)皮細胞的保護作用。
　　結果：
　　PMA刺激PMN可產(chǎn)生NETs，免疫熒光染色顯示在PMN周圍形成網(wǎng)狀結構，應用picogreen熒光酶標儀檢測到加入PMA刺激的PMN組比對照組上清液中cfDNA/NETs的濃度增加（P＜0.05）。應用NETs誘導臍靜脈內(nèi)皮細胞，可見到內(nèi)皮細胞活性明顯被抑制，且隨著NETs

4、濃度的增加（10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml），內(nèi)皮細胞細胞抑制率逐漸上升，與對照組相比差異顯著(10.896％、17.352％、28.125％，P＜0.05)。加入DNase后，NETs誘導的內(nèi)皮細胞活性降低可被拮抗，進一步證明內(nèi)皮細胞活性降低的原因是由于NETs的損傷作用。在NETs誘導內(nèi)皮細胞損傷后，分別加入不同濃度的肝素（0.01U/mL、0.1 U/mL、1.0U/mL、10U/mL）干預，應用MTT法檢測內(nèi)皮細