蓮房原花青素誘導(dǎo)ROS積蓄介導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬和凋亡的研究.pdf

1、蓮房是蓮科植物蓮(Nelumbo nucifera Gaertn.)的成熟花托( lotus seedpod)。蓮房富含多種生物體合成所必需化學(xué)成分包括蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪、酚類物質(zhì)、酮類物質(zhì)、微量元素、酸類物質(zhì)、必需氨基酸等。然而卻被當(dāng)作廢棄物大量丟棄，資源未被利用，造成浪費(fèi)。課題組研究發(fā)現(xiàn)蓮房中原花青素(procyanidins of lotus seedpod, LSPCs)含量很高，并確定LSPCs是由兒茶素或表兒茶素以C4

2、-C8或C4-C6鍵連接而成的2-4聚體組成的化合物。LSPCs已被證實(shí)有抗氧化、抗炎消腫、止血化瘀、抗輻射、降血脂、延緩衰老以及抗腫瘤等多種生物活性，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)初步確定LSPCs誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞自噬和凋亡。本論文致力于研究LSPCs通過(guò)活性氧(ROS)積蓄介導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬、凋亡及其分子機(jī)制，并且基于ROS研究LSPCs誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和自噬之間的相關(guān)性以及共同調(diào)控的信號(hào)通路。具體研究?jī)?nèi)容和實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　1.

3、 LSPCs誘導(dǎo)ROS積蓄介導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬的研究
　　利用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測(cè)HepG2細(xì)胞活性；單丹磺酰戊二胺(MDC)熒光染色實(shí)驗(yàn)和綠色熒光膜連輕鏈蛋白3(GFP-LC3)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)用來(lái)檢測(cè)自噬小體的含量及分布、透射電鏡及激光共聚焦用來(lái)觀察自噬小泡的結(jié)構(gòu)形態(tài)；Western blotting法檢測(cè)自噬蛋白膜連輕鏈蛋白3(LC3)的表達(dá)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化；氧化敏感探針(DCFH-DA)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS

4、含量；JC-1染色用來(lái)檢測(cè)線粒體膜電位；彗星實(shí)驗(yàn)用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞DNA損傷。結(jié)果如下：
　　（1）LSPCs抑制HepG2細(xì)胞增殖具有時(shí)間和劑量依賴效應(yīng)。100μg/mL的LSPCs作用HepG2細(xì)胞96 h后，細(xì)胞抑制率達(dá)到最高值(89.20±5.10)％。LSPCs作用細(xì)胞6~96h后，IC50值在(495.51±0.34)μg/mL和(29.66±0.27)μg/mL之間。
　　（2）LSPCs誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬。其中

5、，50μg/mL的LSPCs作用細(xì)胞24h后，誘導(dǎo)自噬的效果最明顯，細(xì)胞內(nèi)自噬小體分布最多且熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，同時(shí)LC3自噬蛋白熒光也最強(qiáng)以及自噬小泡數(shù)量最多，LC3-I向LC3-II轉(zhuǎn)換明顯增多，而自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)能夠抑制LSPCs誘導(dǎo)的自噬。
　?。?）LSPCs可以阻滯HepG2細(xì)胞于S期，降低細(xì)胞周期蛋白A的表達(dá)，并且導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷。3-MA可以防止細(xì)胞阻滯于S期，上調(diào)細(xì)胞周期A的表達(dá)，預(yù)防LSPCs造

6、成的DNA損傷。
　　（4）LSPCs可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS大量積蓄，且ROS生成量隨LSPCs濃度的升高而升高，并導(dǎo)致線粒體膜電位損失。ROS抑制劑N-acetylcysteine(NAC)能夠抑制LSPCs誘導(dǎo)的自噬，降低細(xì)胞的死亡率。LSPCs誘導(dǎo)ROS積蓄介導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬性死亡可能與線粒體通路有關(guān)。
　　2. LSPCs誘導(dǎo)ROS積蓄介導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的研究
　　利用MTT法用來(lái)檢測(cè)LSPCs對(duì)

7、HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用；Hochest33258染色觀察細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)凝聚狀況；Annexin V-FITC/PI雙染色用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞早期及晚期凋亡率；彗星實(shí)驗(yàn)用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞DNA損傷；DCFH-DA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS含量， JC-1染色用來(lái)檢測(cè)線粒體膜電位變化；Western blotting法檢測(cè)cytochrome c、caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)。結(jié)果如下：
　　（1）LSPCs

8、顯著抑制HepG2細(xì)胞增殖，凋亡抑制劑Z-VAD-FMK(Z-VAD)、ROS的抑制劑NAC均能削弱LSPCs對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用。
　?。?） LSPCs誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。LSPCs作用細(xì)胞后，核染色體高度凝聚，細(xì)胞核碎裂，核固縮，染色質(zhì)凝聚的細(xì)胞數(shù)從3.86%增至42.76%；活細(xì)胞率急劇減少，凋亡率從對(duì)照組的5.32%增至67.05%；cytochrome c、caspase-3、caspase-9蛋白的表達(dá)

9、量顯著增加。Z-VAD和NAC能有效抑制LSPCs造成的細(xì)胞凋亡。
　?。?）LSPCs誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS積蓄，導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷及線粒體膜電位的損失，Bax蛋白的表達(dá)增加，Bcl-2蛋白的表達(dá)減少，Bax/Bcl-2的比例值升高。結(jié)果表明LSPCs可通過(guò)ROS介導(dǎo)的線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。另外，Z-VAD和NAC能夠抑制線粒體膜電位損失及caspase相關(guān)蛋白的表達(dá)，阻斷LSPCs導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。
　　3. LSP

10、Cs誘導(dǎo)ROS積蓄介導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬與凋亡相關(guān)通路的研究
　　Hochest33258染色觀察100μg/mL LSPCs作用24 h后細(xì)胞凋亡形態(tài)，Annexin V-FITC/PI雙染色檢測(cè)凋亡率，研究3-MA對(duì)凋亡作用的影響；利用GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染檢測(cè)100μg/mL LSPCs作用24 h后細(xì)胞自噬形態(tài)，研究Z-VAD對(duì)自噬作用的影響；Western blotting法檢測(cè)自噬與凋亡共同調(diào)節(jié)的蛋白通路包括Bax、B

11、ad、Bcl-2、磷脂酰肌醇3羥基激酶PI3K/AKT/mTOR、絲/蘇氨酸蛋白激酶ERK及c-Jun氨基末端激酶JNK等信號(hào)通路蛋白的表達(dá)。結(jié)果如下：
　?。?）自噬抑制劑3-MA能夠下調(diào)LSPCs引起的HepG2細(xì)胞核聚縮作用，顯著降低細(xì)胞凋亡率，結(jié)果表明抑制自噬能夠抑制LSPCs誘導(dǎo)的凋亡。
　?。?）凋亡抑制劑Z-VAD能夠阻止GFP-LC3蛋白轉(zhuǎn)移至自噬雙層膜，綠色熒光斑點(diǎn)顯著減少，且對(duì)應(yīng)的LC3-II蛋白表達(dá)量減

12、少，結(jié)果表明抑制凋亡能夠抑制LSPCs誘導(dǎo)的自噬。
　?。?）3-MA和NAC預(yù)處理后Bax和Bad、cleaved caspase3蛋白表達(dá)均呈現(xiàn)下降，Bcl-2的蛋白表達(dá)增加，3-MA、NAC抑制了凋亡蛋白的表達(dá)，線粒體蛋白通過(guò)ROS積蓄介導(dǎo)自噬和凋亡。
　　（4）P13K通路的抑制劑3-MA、ROS抑制劑NAC可以抑制PI3K，P-AKT和P-mTOR蛋白的表達(dá)量的下調(diào)以及cleaved caspase3的增加，結(jié)果顯

13、示通過(guò)阻滯PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路可以促進(jìn)細(xì)胞自噬和凋亡。LSPCs誘導(dǎo)的ROS積蓄參與調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR途徑，從而調(diào)控HepG2細(xì)胞的自噬與凋亡。
　　（5）LSPCs作用細(xì)胞后，P-JNK、P-ERK、自噬蛋白LC3-II以及凋亡蛋白cleaved caspase3表達(dá)量增加，表明LSPCs通過(guò)促進(jìn)JNK、ERK的磷酸化，誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬與凋亡。JNK通路抑制劑SP600125和NAC均能抑制JNK