TRIM11通過MCL1調控線粒體功能及細胞凋亡.pdf

1、細胞凋亡是機體在生長發(fā)育，維持機體良性運轉以及應對外界刺激時一種非常重要的主動的的細胞程序性死亡。它的失調會導致很多疾病的發(fā)生，比如阿爾茲海默癥、癌癥、艾滋病以及心臟病等。在凋亡過程中有許多蛋白家族參與其中，比如caspaSe家族和BCL2家族。Bcl2家族蛋白可以通過促進或抑制線粒體膜的通透性調節(jié)細胞的凋亡進程。本篇研究中，我們發(fā)現(xiàn)了一個與神經發(fā)育相關的泛素E3連接酶TRIM11能夠結合并降解Bcl2家族蛋白中的抗凋亡蛋白MCL1，從

2、而導致線粒體膜電位下降和細胞凋亡。本論文的主要工作如下:
　　1.通過MTT實驗檢測TRIM11對細胞增殖能力的影響，發(fā)現(xiàn)TRIM11會明顯抑制HeLa細胞和HEK293T(293T)細胞的增殖能力。同時發(fā)現(xiàn)TRIM11在血清饑餓條件下能更加明顯地抑制細胞增殖。使用碘化丙啶染色，流式檢測TRIM11對細胞周期的影響，發(fā)現(xiàn)TRIM11對293T細胞的細胞周期并沒有明顯影響。使用AnnexinⅤ/PI雙染，流式檢測TRIM11對細胞凋

3、亡的影響，發(fā)現(xiàn)TRIM11明顯促進細胞早期凋亡，在血清饑餓條件下，細胞晚期凋亡比例上升。
　　2.通過細胞細胞核質分離技術和免疫熒光檢測TRIM11在細胞中的分布，發(fā)現(xiàn)TRIM11主要分布在細胞質中。然后通過蛋白序列比對，發(fā)現(xiàn)TRIM11的已知底物Humanin與Bcl2家族蛋白中的MCL1、BCL-2、BCL-XL的BH1結構域具有很高的相似性，并最終使用免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)TRIM11和MCL1能夠相互作用，使用免疫熒光檢測TRIM

4、11和MCL1在細胞中定位，發(fā)現(xiàn)兩者共定位于細胞質。
　　3.檢測全長和RING結構域缺失的TRIM11突變體對細胞增殖能力和細胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)RING結構域缺失后，TRIM11抑制細胞增殖和促進細胞凋亡的作用消失，說明TRIM11發(fā)揮促進細胞凋亡功能依賴于RING結構域。然后檢測了TRIM11對外源MCL1蛋白水平的影響，發(fā)現(xiàn)TRIM11可以明顯降低外源MCL1的蛋白水平，并且TRIM11調節(jié)MCL1蛋白水平依賴于蛋白酶體途徑

5、。通過半衰期實驗發(fā)現(xiàn)，TRIM11可以明顯降低外源MCL1和內源MCL1的半衰期。最后通過免疫共沉淀檢測TRIM11對MCL1泛素化水平的影響，發(fā)現(xiàn)TRIM11能明顯提高MCL1的泛素化水平。
　　4.使用線粒體熒光標記物JC-1檢測TRIM11對HeLa細胞和293T細胞線粒體膜電位的影響，發(fā)現(xiàn)TRIM11使線粒體膜電位降低，揭示TRIM11主要是通過影響線粒體功能影響細胞凋亡的。使用線粒體分離試劑盒分離線粒體并檢測MCL1、T