SIN1通過調(diào)控上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移.pdf

1、原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上最為常見的惡性腫瘤之一。其發(fā)病率居男性惡性腫瘤的第五位，死亡率居男性惡性腫瘤第二位。全球每年新發(fā)病例約748300人，年死亡病例達(dá)695900人。隨著肝臟外科技術(shù)的進(jìn)步，肝癌的手術(shù)治療水平已有顯著提高，但其術(shù)后5年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率仍高達(dá)70％，嚴(yán)重制約了肝癌患者整體治療水平的提高。因此，深入研究肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的機制，探索有效的預(yù)防和治療復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的手段是當(dāng)今肝癌研究

2、的熱點，對于進(jìn)一步提高肝癌患者整體治療水平具有十分重要的意義。
　　應(yīng)激活化蛋白激酶作用蛋白1(SAPK interacting protein1，SIN1)新近發(fā)現(xiàn)的胚胎發(fā)育關(guān)鍵蛋白。SIN1被認(rèn)定為TORC2關(guān)鍵組成成分，可通過調(diào)控AKT磷酸化影響AKT下游信號通路。眾所周知，AKT信號通路對包括肝癌在內(nèi)的惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移發(fā)揮著重要的作用，尤其是近年來大量研究發(fā)現(xiàn)AKT信號通路可以調(diào)控上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。這些

3、均提示SIN1很可能在肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。為此，本課題試圖研究SIN1在肝癌組織樣本及肝癌細(xì)胞系中表達(dá)水平，并結(jié)合隨訪資料，分析SIN1與肝癌臨床病例特征的關(guān)聯(lián)以及SIN1與肝癌患者生存預(yù)后的關(guān)系。我們利用siRNA干擾技術(shù)在肝癌細(xì)胞系中抑制SIN1的表達(dá)，從體外和體內(nèi)研究SIN1對肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用，并探討了SIN1對肝癌上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的調(diào)控作用。以期闡明SIN1在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及其作用機制。我們的研究結(jié)果表明:

4、r>　　1.SIN1 mRNA和蛋白在肝癌組織和肝癌細(xì)胞系中顯著高表達(dá)首先我們通過實時定量PCR檢測了30對肝癌組織以及相應(yīng)癌旁組織中SIN1 mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示SIN1 mRNA在肝癌組織中顯著高表達(dá)（中位值為2.2倍）。通過western blot檢測SIN1蛋白在肝癌組織以及相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)，結(jié)果表明SIN1蛋白在肝癌組織中的表達(dá)水平顯著高于鄰近非癌肝組織（P＜0.05）。通過進(jìn)一步分層分析我們發(fā)現(xiàn)，SIN1在孤立性

5、大肝癌(SLHCC)中的表達(dá)水平顯著低于結(jié)節(jié)性肝癌(NHCC)（P=0.016），而與小肝癌(SHCC)之間則沒有顯著差別（P＞0.05）。我們進(jìn)一步采用real-time PCR和western blot檢測了SIN1 mRNA及蛋白在正常肝細(xì)胞系L02，以及五種不同的肝癌細(xì)胞系HepG2、MHCC97-L、MHCC97-H、HCCLM3和SMMC-7721中的表達(dá)水平。實驗結(jié)果顯示:SIN1在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平顯著高于正常肝細(xì)胞

6、系L02（P＜0.05），且SIN1在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平隨著各肝癌細(xì)胞系侵襲轉(zhuǎn)移潛能的增強而增高，提示SIN1與肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。同時，我們還選取了SIN1表達(dá)水平最高的HCCLM3和MHCC97-H細(xì)胞系作為下一步的研究對象。
　　2.SIN1表達(dá)水平與肝癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系通過免疫組化檢測SIN1在60對肝癌組織和相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)，結(jié)果同樣表明其在肝癌組織呈顯著高表達(dá)，且SIN1高表達(dá)組的總體生存率和無瘤生

7、存率均顯著低于SIN1低表達(dá)組（P＜0.05），提示SIN1高表達(dá)組的肝癌病人預(yù)后較差。而且研究尚發(fā)現(xiàn)SIN1表達(dá)水平與腫瘤結(jié)節(jié)個數(shù)（P=0.012），包膜形成（P=0.037），血管浸潤（P=0.023），及TNM分期(P=0.020)密切相關(guān)。
　　3.SIN1在體外能顯著增強肝癌細(xì)胞的運動和侵襲能力為了研究SIN1在體外對肝癌細(xì)胞運動和侵襲能力的影響，我們首先構(gòu)建了SIN1siRNA，通過慢病毒轉(zhuǎn)染SIN1相對高表達(dá)的HCC

8、LM3和MHCC97-H細(xì)胞系，采用western blot驗證SIN1 siRNA干擾效率。通過劃痕愈合實驗和Transwell侵襲小室實驗研究SIN1對肝癌細(xì)胞系HCCLM3和MHCC97-H侵襲運動能力的影響。劃痕愈合實驗結(jié)果顯示HCCLM3SIN1-RNAi遷移運動能力較HCCLM3NC細(xì)胞明顯減弱（95％ versus45％，P＜0.05）;Transwell實驗結(jié)果顯示HCCLM3SIN1-RNAi細(xì)胞侵襲能力較 HCCLM

9、3NC細(xì)胞明顯下降（161±18 versus56±13，P＜0.05）;同樣，在MHCC97-H細(xì)胞系中也得到了相似的結(jié)果(P＜0.05)。提示下調(diào)SIN1的表達(dá)可顯著抑制肝癌細(xì)胞的侵襲運動能力。
　　4.SIN1在體內(nèi)能促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移為了研究SIN1在體內(nèi)對肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用，我們構(gòu)建了人肝癌細(xì)胞裸鼠肝臟原位種植模型。我們選擇侵襲轉(zhuǎn)移潛能最強同時也是SIN1表達(dá)水平最高的細(xì)胞系HCCLM3來進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，HCCLM3SIN

10、1-RNAi組肝癌肝內(nèi)轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)目較HCCLM3NC組明顯減少(7±3 versus15±5，P＜0.05)，明顯提示降低SIN1表達(dá)水平可以明顯抑制肝癌在裸鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移。
　　5.SIN1調(diào)控上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化已有的研究表明SIN1是調(diào)控AKT磷酸化的關(guān)鍵蛋白，而大量研究證實AKT磷酸化對上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)揮了非常重要的調(diào)控作用。由此，我們推測SIN1很可能通過調(diào)控AKT磷酸化參與了肝癌上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移。為此

11、，我們在HCCLM3和MHCC97-H兩個肝癌細(xì)胞系中開展了一系列研究。結(jié)果表明降低HCCLM3和MHCC97-H細(xì)胞系中SIN1的表達(dá)水平后AKT磷酸化明顯減少（P＜0.05）。而且上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白Snail，Vimentin，N-cadherin，MMP9的表達(dá)亦明顯減少（P＜0.05），而E-cadherin的表達(dá)則顯著增高（P＜0.05）。在HCCLM3SIN1-RNAi和MHC97-HSIN1-RNAi細(xì)胞中過表達(dá)Sn