基因治療人類CRB1突變引起的視網膜色素變性的方案探索.pdf

1、目的:
　　感光細胞退行性病變是人類的一種常見致盲性疾病，嚴重危害人類健康，但目前針對這類疾病仍沒有良好的醫(yī)療手段?，F(xiàn)今，基因治療和干細胞治療是兩類具有較好前景的治療方案。在人類諸多與視網膜退行性病變相關的基因當中，CRB1基因不同位點的突變可以引起視網膜色素變性（Retinitis pigmentosa，RP）和利伯氏先天性黑蒙(Leber congenital amaurosis，LCA)，但目前尚未有關于此基因突變進行基因治

2、療的報道，主要原因之一是CRB1基因比較大，不符合基因治療的載體腺相關病毒(Adeno-associated virus，AAV)對基因片段大小的要求，且其編碼的蛋白質結構復雜，各結構域的功能尚不十分明確。鑒于此，本論文旨在以斑馬魚為模型，分析其Crb2a蛋白各結構域的功能，在此基礎上探索對人類因CRB1功能缺陷引起的RP和LCA的基因治療方案。
　　方法:
　　首先，通過生物信息學比較斑馬魚不同Crb異構體與哺乳動物CRB

3、1之間的同源性，確定crb2a為斑馬魚中與哺乳動物CRB1同源的基因。然后，對斑馬魚 Crb2a蛋白的各結構域分區(qū)進行預測，結合對比分析自然界原本存在的不同異構體，分別克隆各單個結構域或結構域組合，在斑馬魚和細胞中分別檢測其對crb2a突變魚系表型的修復情況，介導蛋白——蛋白自身粘連的能力等，以此研究Crb2a各結構域的功能。在此基礎上，選擇基因大小適宜且保留Crb2a功能的重組形式，通過轉基因技術在斑馬魚中驗證對CRB1突變引起的視網

4、膜疾病進行基因治療的可行性。
　　結果:
　　生物信息學分析表明，crb2a具有3個Laminin G結構域和16個EGF結構域。同時，盡管自然界中獲得廣泛認可的具有功能的Crb蛋白通常由以上結構域組成，但cDNA克隆表明crb2a具有多種不同的剪接轉錄形式。在此基礎上，我們通過基因工程技術，獲得了8種不同結構域組合的重組crb2a。經體外轉錄成mRNA后，顯微注射到斑馬魚胚胎中，觀察是否能修復crb2a突變魚系表型。結果證