重癥肌無力患者肌細胞分揀微管連接蛋白17的表達及作用分析.pdf

1、研究背景:重癥肌無力(myasthenia gravis,MG)是最常見的神經肌肉接頭（NMJ）免疫疾病，世界范圍內發(fā)病率約為200-300/百萬，臨床特點包括肌肉無力和易疲勞性，肌無力通常會在活動后加重，休息或睡眠后緩解。神經肌肉接頭是由高度特化的運動神經元構成的突觸前膜、突觸間隙、以及由肌細胞膜構成的突觸后膜組成，作用是參與神經肌肉之間的信號傳導，將神經興奮信號轉化為肌肉收縮。運動神經元末梢釋放乙酰膽堿（ACh）活化突觸后膜的乙酰膽

2、堿受體（AChR），導致肌細胞膜表面離子通道開放，使肌細胞去極化。AChR在反復折疊的突觸后膜呈高密度簇集分布，這種簇集分布是信號傳導的重要保證。哺乳動物在出生以后，神經肌肉接頭的突觸后膜形成褶皺樣結構，AChR聚集在這些褶皺上，經過測算可知其在突觸后膜上的10000-20000/um2，而在突觸外的結構上密度僅為10/um2，這種現象涉及復雜的NMJ處的信號傳遞通路，目前關于AChR在NMJ的調節(jié)及聚集機制仍不明確。
　　過去的

3、幾十年中，已經證實神經肌肉接頭處有很多神經源性、肌源性以及促進不同分化的信號因子。這些因子包含跨膜蛋白、胞質內蛋白、以及胞外的一些重要蛋白，突觸處的基本蛋白包含兩種主要物質即集聚蛋白（Agrin）和神經調節(jié)蛋白，這兩種物質由運動神經元產生，并且在NMJ的結構形成和維持方面有一定作用，其它的胞外蛋白如層聯蛋白、IV/XIII膠原蛋白，蛋白多糖對NMJ形成也有一定作用。在肌細胞膜表面，肌肉特異性酪氨酸激酶（MuSK）是募集其它胞內、胞外物質

4、的關鍵蛋白。膜表面低密度脂蛋白受體相關蛋白4（LRP4）與MuSK形成的復合體對于NMJ的功能至關重要。在肌細胞內部，很多蛋白如rapsyn蛋白、Dok7可以和MuSK結合傳遞信號誘導AChR在突觸后膜的聚集。目前，研究者普遍認為Agrin-LRP4-MuSK復合體的信號傳遞通路在NMJ形過程起到重要作用，目前對這個復合體功能已有一定的認識，AChR的簇集需要運動神經元分泌的Agrin蛋白和突觸后膜的LRP4蛋白結合，Agrin-LRP

5、4復合體激活突觸后膜MuSK蛋白，誘導AChR在突觸后膜聚集。
　　低密度脂蛋白受體相關蛋白4（LRP4）與低密度脂蛋白受體相關蛋白1（LRP1）均屬于LDLR家族成員，研究已經表明LRP1在細胞內的代謝與細胞分揀微管連接蛋白17（SNX17）有關，SNX17屬于細胞分揀微管連接蛋白(sorting nexin，SNX)家族成員，SNX家族包括存在于胞內和胞膜的多種蛋白質，其作用是參與跨膜蛋白的內吞及在胞質內的分揀，SNX17蛋白

6、誘導LRP1在細胞內的循環(huán)利用，抑制LRP1被溶酶體降解，LRP1與LRP4具有相同的結構域即NPxY結構域，因此LRP4存在與SNX17結合的可能。
　　SNX17分布于所有組織，我們研究團隊前期研究發(fā)現MG患者胸腺中SNX17mRNA含量明顯增高，但SNX17在肌肉的表達情況及對NMJ處LRP4代謝影響情況未知。本研究在比較MG患者SNX17分子含量基礎上，用免疫熒光觀察SNX17與AChR形態(tài)，了解MG患者肌細胞SNX17分

7、子表達情況，分析與AChR分子的關系。
　　目的:本研究采用免疫熒光法觀察肌絲AChR、SNX17分子形態(tài)及分布；熒光定量PCR、蛋白免疫印跡法比較兩組肌細胞SNX17含量。
　　方法:
　　1.免疫熒光法觀察大鼠AChR及人AChR、SNX17分子形態(tài)：取大鼠、MG組和對照組肋間肌標本，4％多聚甲醛固定10min，在載玻片上的剝離單根肌絲，0.5%Triton X-100通透20min，5%BSA封閉1h，稀釋比例1

8、：50的鼠抗人SNX17抗體孵育4℃過夜。37℃復溫30min，稀釋比例1：100的AF-g350標記羊抗鼠抗體及1：220的α-銀環(huán)蛇毒素標記的四甲基羅丹明（α-BTX），37℃孵育1h，顯微鏡觀察不同激發(fā)光下的AChR、SNX17形態(tài)及分布。
　　2.熒光定量PCR法檢測肌細胞SNX17 mRNA含量：在Gene Bank中獲得人SNX17序列，Premier5.0設計引物,上游引物序列5，-CAATGGGT CTTGCCGA

9、ACAG-3，下游引物序列5,CGCCTACGTGGCCTATAACAT-3，β-actin作為內參，其上游引物序列為5，-GGGCCGGACTCGTCATACT-3，下游引物序列為5，-CCTGGCACCCAGCACAAT-3，取上述肋間肌各20mg，用Trizol一步法提取RNA，按反轉錄試劑盒說明書將RNA反轉成cDNA，熒光定量PCR法采用20ul反應體系,熒光變性反應條件為95℃30S；PCR反應條件：95℃5S、55℃2mi

10、n、72℃30S，40個循環(huán)；取10ulPCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，以確保引物設計的特異性。將內參基因Ct值與目的基因的Ct值之比作為標準化的目的基因相對定量，即β-actin的拷貝數/目的基因拷貝數。
　　3.蛋白免疫印跡法檢測肌細胞SNX17蛋白含量：取上述肋間肌各20mg，液氮中快速研磨得到勻漿，加入裂解液，室溫避光30min，5000r/min離心5min后取上清，BCA法測細胞蛋白濃度，每孔加20μl樣品，β-ac

11、tin作為內參，稀釋比例1：1000鼠抗人SNX17抗體及1：2000兔抗人β-actin抗體孵育4℃過夜，37℃復溫30min，稀釋比例1：4000HRP標記的羊抗鼠抗體和1：4000HRP標記的羊抗兔抗體37℃孵育1h，曝光成膠片，采用圖像分析軟件Quantity One分別測定目的基因和β-actin的顯色條帶平均值，各組蛋白表達強度為二者平均值比值。
　　結果:
　　1.患者一般臨床資料：對MG組（10例）與對照組（

12、14例）的年齡、性別進行比較，兩組患者的年齡、性別差異無統(tǒng)計學意義（表1）。
　　2.AChR、SNX17形態(tài)學觀察：AChR一般位于肌纖維縱軸的中部，呈紅色橢圓形突起狀，輪廓線光滑連續(xù)完整。對照組AChR呈曲奇餅干樣，內部有精細分支的網絡狀結構；而MG組僅可觀察到呈不連續(xù)完整的紅色外周輪廓線，內部網狀結構破碎，呈空泡樣；但可觀察到SNX17呈同樣形狀藍色橢圓形突起，兩者位置、形態(tài)一致，經Merge后，圖像完全重疊（圖1、圖2）。

13、
　　3.肌細胞中SNX17基因和蛋白定量結果：熒光定量PCR法結果顯示，MG組SNX17 mRNA含量明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（t=5.75，P<0.05），蛋白免疫印跡法結果顯示，SNX17蛋白含量明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.03，P<0.05）（圖3，表1）。
　　結論:
　?。?）MG患者肋間肌肌細胞SNX17表達增高，存在促進LRP4在細胞內再循環(huán)的可能性。
　?。?）SNX17與AChR在神