低氧微環(huán)境促進OM-MSCs增殖及向多巴胺能神經元分化的研究.pdf

1、目的:
　　研究低氧微環(huán)境是否能促進嗅黏膜間充質干細胞(OM-MSCs)增殖和低氧微環(huán)境下利用嗅鞘細胞(OECs)上清液誘導OM-MSCs向多巴胺能神經元分化及其相關的機制。
　　方法:
　　1.OM-MSCs和OECs培養(yǎng)與鑒定:分離培養(yǎng)OM-MSCs和OECs，應用流式細胞學、Western Blot及免疫熒光方法對兩種細胞分別進行鑒定。
　　2.OM-MSCs在低氧微環(huán)境下增殖:實驗將含10％FBS培養(yǎng)基培

2、養(yǎng)的OM-MSCs分成三組:3％O2+YC-1（HIF-1α抑制劑）組、3％O2組、21％O2組（常氧組），共同培養(yǎng)72h后先對細胞核進行免疫熒光染色、細胞流式檢測細胞增殖及凋亡情況，再應用Western blot方法檢測各組增殖細胞核抗原(PCNA)蛋白表達的情況。
　　3.OM-MSCs在低氧微環(huán)境下用OECs上清液誘導其分化:實驗將OM-MSCs分為另外三組:3％O2+YC-1+OECs上清誘導組（低氧A組）、3％O2+OE

3、Cs上清誘導組（低氧B組）及21％O2+OECs上清誘導組（常氧對照組），用免疫熒光檢測分化后的多巴胺能神經元，用Q-PCR及Western blot分別檢測各組mRNA及蛋白表達情況，最后用膜片鉗檢測分化的神經元離子通道開放情況及ELISA檢測分化后細胞上清中多巴胺的含量。
　　結果:
　　1.OM-MSCs和OECs培養(yǎng)與鑒定:分離培養(yǎng)出了OM-MSCs和OECs，并應用流式細胞學檢測出OM-MSCs的純度達99％;對培

4、養(yǎng)的OECs用免疫熒光進行鑒定，能表達OECs標記物P75，又經Western Blot對OECs進行了進一步鑒定顯示:GFAP和P75均有表達。
　　2.OM-MSCs在低氧微環(huán)境下增殖及凋亡檢測結果顯示:3％O2組比21％O2組的增值系數(shù)(PI)大，且兩組間的細胞存活及凋亡比例無顯著差異;3％O2組OM-MSCs核染色明顯比其他兩組比例要高，且21％O2組的細胞核數(shù)量最少;Western blot檢測顯示3％O2組的PCNA蛋

5、白表達顯著增高，同樣21％O2組的表達最少。
　　3.OM-MSCs在低氧微環(huán)境下用OECs上清液誘導分化檢測結果顯示:低氧B組OM-MSCs經OECs誘導后免疫熒光βⅢ-tubulin表達最多，且表達TH神經元（多巴胺能神經元）;Q-PCR顯示低氧B組HIF-1α及下游靶基因TH表達明顯增高(P＜0.05);Western blot表明B組中βⅢ-tubulin和TH蛋白表達顯著增多，而GFAP蛋白表達明顯降低(P＜0.05);

6、另外，誘導分化后的神經元經膜片鉗檢測發(fā)現(xiàn)鉀離子電流，且ELISA檢測結果顯示低氧B組中分泌的多巴胺濃度顯著增加(P＜0.05)。
　　結論:
　　低氧微環(huán)境能促進OM-MSCs的增殖且對其細胞活性無影響;低氧微環(huán)境下培養(yǎng)的OM-MSCs經OECs上清液誘導后能顯著提高其向神經元分化的比例及向多巴胺能神經元分化的比例，明顯降低了向膠質細胞分化的能力，且低氧微環(huán)境下分化的細胞能分泌更高濃度的多巴胺，此過程與OM-MSCs內HIF