人類胚胎干細胞誘導分化為多巴胺能神經(jīng)元的實驗研究.pdf

1、[目的]：建立體外誘導人的胚胎干細胞(hESCs)分化為多巴胺能神經(jīng)元的條件，以期在培養(yǎng)系統(tǒng)中獲得更多的較純的、具有功能的多巴胺能神經(jīng)元，為細胞移植治療帕金森病的研究開辟新的前景。 [方法]：將hESCs置于小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)飼養(yǎng)層上培養(yǎng)，細胞接近融合狀態(tài)時進行傳代，程序降溫法凍存，速溶方法復蘇，確定解凍后細胞復蘇率、克隆生長與分化情況，并對其生物學特性進行鑒定。 分三階段誘導hESCs定向生成神經(jīng)干細胞(NS

2、Cs)。形態(tài)學觀察結合免疫熒光細胞化學和RT-PCR檢測神經(jīng)干細胞標志；NSCs分化試驗對所誘導的NSCs的分化潛能進行檢測。 模擬體內(nèi)多巴胺神經(jīng)元分化發(fā)育的不同階段及微環(huán)境，采用早期添加音猥因子(SHH)及成纖維細胞生長因子-8(FGF8)的方法，誘導hESCs定向生成多巴胺能神經(jīng)元(A組)，并與傳統(tǒng)的誘導方法(B組)相比較，免疫熒光細胞化學和RT-PCR法檢測多巴胺能神經(jīng)元的標志，高效液相色譜法檢測誘導后細胞及細胞培養(yǎng)上清液

3、中多巴胺(DA)及其代謝產(chǎn)物高香草酸(HVA)的含量。 建立帕金森病(PD)大鼠模型，隨機分為治療組和對照組。利用立體定位技術將分化后的細胞移植到PD大鼠的紋狀體內(nèi)，對照組植入生理鹽水。免疫組化法證實移植細胞的存活并以誘發(fā)旋轉(zhuǎn)行為的改善來觀察其治療作用。 [結果]：hESCs穩(wěn)定增殖了5個月，傳代20代：細胞在MEF上呈集落生長，細胞核大，核仁明顯。程序降溫法凍存后復蘇，細胞復蘇率達到78.3％；解凍后第12代細胞仍具有

4、穩(wěn)定的46XX核型；表達hESCs特異性蛋白及基因。 經(jīng)三步法最終可誘導形成純度高達90％以上的nestin陽性細胞，表達nestin基因；所誘導生成的細胞反復傳代，仍表現(xiàn)為nestin陽性，并可進一步分化為神經(jīng)元、星形神經(jīng)膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞。 誘導的細胞表達多巴胺能神經(jīng)元的特異性基因及蛋白。A組TH的陽性表達率(73.68±4.71％)明顯高于B組(31.37±1.63％)；RF-PCR檢測結果顯示A組TH、Nur

5、r1、Lmx1B表達量均高于B組；高效液相色譜方法檢測A組終止誘導后細胞內(nèi)及細胞外DA、HVA含量均高于B組(P＜0.01，P＜0.05)。 移植前1-4周、移植后1-8周大鼠旋轉(zhuǎn)行為檢測結果：治療組由移植前289±60圈/30分鐘下降至229±37(P＜0.05)；而對照組移植前(290±47)，移植后(286±34)，臨床表現(xiàn)無改善(P＞0.05)。TH免疫組化染色顯示移植后治療組大鼠紋狀體內(nèi)存在著TH陽性細胞，散在分布；而

6、對照組紋狀體內(nèi)未見TH陽性細胞。 [結論]：成功建立了hESCs體外培養(yǎng)模式，為研究hESCs及相關疾病的防治提供細胞模型和細胞來源；三步誘導法可誘導hESCs生成較高純度的NSCs，并能較好維持其干細胞特性和具有進一步分化的能力；SHH及FGF8早期聯(lián)合作用可高效的促進hESCs分化為多巴胺能神經(jīng)元，且這些神經(jīng)元有分泌多巴胺的功能；誘導分化出的多巴胺能神經(jīng)元移植后，PD模型大鼠行為學明顯改善，對PD有一定的治療作用，為臨床治療