誘導胚胎干細胞分化為角膜上皮細胞的實驗研究.pdf

1、經(jīng)初步誘導后，于活體角膜基質(zhì)板層及基質(zhì)細胞組成的微環(huán)境上觀察鼠胚胎干細胞分化為角膜上皮細胞的情況。探索在體角膜基質(zhì)板層及基質(zhì)細胞構(gòu)成的微環(huán)境誘導胚胎干細胞分化為角膜上皮細胞的可能性及誘導條件，為解決構(gòu)建組織工程角膜治療嚴重眼表疾病的種子細胞來源問題提供新途徑。 方法： 1．培養(yǎng)鼠胚胎干細胞(轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白的BALB/c小鼠胚胎干細胞系GFP-ESC)，脫去飼養(yǎng)層培養(yǎng)兩代后使用視黃酸(RA)初步誘導。 2．利用庚

2、醇制作新西蘭白兔角膜上皮缺損模型，將經(jīng)視黃酸(RA)初步誘導的胚胎干細胞(GFP-ESC)移植到角膜基質(zhì)板層及基質(zhì)細胞上，利用基質(zhì)板層誘導胚胎干細胞分化為角膜上皮的實驗研究及基質(zhì)細胞形成的微環(huán)境促進胚胎干細胞的定向分化，增加GFP-ESC向角膜上皮細胞的分化效率；對側(cè)眼以生理鹽水做對照，分別于移植12h，24h，4w,8w后行裂隙燈檢查、角膜熒光素染色，取材進行蘇木素-伊紅(HE)染色、組織切片熒光照相、免疫組織化學檢查GFP、AE5(

3、角蛋白CK3/12)的表達。 結(jié)果： 1．胚胎干細胞(GFP-ESC)在飼養(yǎng)層上生長良好，呈克隆樣生長，表達較強的綠色熒光蛋白(GFP)標記，撤去飼養(yǎng)層培養(yǎng)兩代后生長情況及標記蛋白表達無明顯變化。 2．利用庚醇制作新西蘭白兔角膜上皮缺損模型：切片HE染色示無角膜上皮細胞殘留，角膜基質(zhì)面光滑，基質(zhì)板層及基質(zhì)細胞結(jié)構(gòu)完整規(guī)則。 3．胚胎干細胞(GFP-ESC)眼表移植12h、24h后取材切片行蘇木素．伊紅(H

4、E)染色、組織切片熒光照相。HE染色示胚胎干細胞(GFP-ESC)呈單層貼附于角膜基質(zhì)板層上；熒光照片亦顯示胚胎干細胞呈單層貼附于角膜基質(zhì)板層上，細胞GFP陽性。 4．胚胎干細胞(GFP-ESC)眼表移植4周、8周后行裂隙燈檢查，眼表上皮化良好：熒光素不著染、角膜透明、新生血管少；組織切片AE5染色陽性，上皮和基底膜結(jié)合緊密，上面4～6層復層細胞，細胞GFP陽性，與正常角膜有相似組織學結(jié)構(gòu)，無結(jié)膜細胞侵入，無畸胎瘤形成。

5、 結(jié)論： 1．使用庚醇制作新西蘭白兔角膜上皮缺損模型是一種簡單、易行、有效的方法，庚醇處理后的角膜無上皮細胞殘留，基質(zhì)面光滑，基質(zhì)板層及基質(zhì)細胞結(jié)構(gòu)完整規(guī)則，適于干細胞貼附； 2．通過視黃酸(RA)初步誘導胚胎干細胞(GFP-ESC)后移植到角膜基質(zhì)及其細胞上，利用角膜基質(zhì)及其細胞形成的微環(huán)境促進胚胎干細胞的定向分化，成功誘導胚胎干細胞轉(zhuǎn)化為角膜上皮樣細胞，增加了其向角膜上皮細胞的分化效率。胚胎干細胞與角膜基質(zhì)結(jié)合緊密，