FTY-720調節(jié)去勢大鼠骨髓間充質干細胞成骨分化Smad信號通路的機制研究.pdf

1、絕經后骨質疏松癥患者因為本身雌激素水平的下降，導致全身骨骼系統(tǒng)代謝平衡紊亂，直至骨質疏松，因此絕經后骨質疏松癥實質上是一種骨代謝異常引起的代謝類疾病。我國中老年婦女絕經后骨質疏松癥的發(fā)病率據不完全統(tǒng)計已達到50％，其根本原因是破骨細胞的骨吸收作用和成骨細胞的骨形成作用嚴重失衡，導致骨量減少和骨顯微結構退化變性，使得骨質脆弱，骨折發(fā)生率高。絕經后骨質疏松癥也是造成頜面部骨質損失的主要危險因素，此種情況一旦發(fā)生，不僅可導致牙槽骨的吸收，還可

2、發(fā)生更為嚴重的牙齦萎縮、牙根暴露、基牙附著喪失、基牙脫落甚至頜骨萎縮等一系列不利于臨床正畸治療的棘手問題，給患者帶來了痛苦和生活質量的下降，同時也給正畸科臨床醫(yī)生的治療帶來巨大的障礙。當前臨床上治療絕經后骨質疏松癥主要采取激素替代療法，或用鈣和其他藥物制劑來抑制骨吸收。由于藥物制劑本身有副作用，再加上吸收不良，療效不穩(wěn)定，患者依從性差等一系列不可控因素，這些方法不能取得令人滿意的治療效果。
　　來源于動物骨髓中的骨髓間充質干細胞（

3、boanae mararowa daeraivaeda mesaencahyamala steama cealalsa,BaMMaSaCas），具有成體干細胞的自我更新和多向分化潛能，能分化為成骨細胞，促進骨的生長、形成以及骨的修復過程。在絕經后骨質疏松癥發(fā)生的同時，來源于患者體內的BMMSCs其成骨分化能力在基因水平衍生出了明顯的缺陷，有研究表明引起絕經后骨質疏松癥患者骨質流失的一個重要因素就是其體內BMMSCs的成骨分化減弱，而成脂

4、分化增強。目前還沒有找到確鑿可靠的方法從基因水平改善絕經后骨質疏松癥患者BMMSCs成骨分化能力減弱的狀況。
　　FTY-720（fingolimod，芬戈莫德）是1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate,S1P）的化學類似物。最初由日本學者從中草藥冬蟲夏草的有效成分多球殼菌素ISP-1改造而成，作為一種新型的免疫制劑廣泛應用于臨床。近來研究發(fā)現，FTY-720有促進成骨樣細胞系向成骨分化的能力。然而，FTY

5、-720能否改善絕經后骨質疏松癥患者BMMSCs受損的成骨能力至今未見報道，且FTY-720促進成骨的相關機制也未見有相關研究。
　　Smad信號通路是成骨分化過程中起關鍵調控作用的信號通路之一。Smads蛋白家族充斥在這個通路各個環(huán)節(jié)中，而其中的Smad4蛋白處于Smad信號通路中游水平，它在分類上屬于通用型轉運蛋白，可以與Smads蛋白家族中的受體型Smad1、2、3、5、8耦合輔助其轉位至細胞核內，調控下游基因的表達，可見其

6、作用之重要。因此，本課題的目的旨在首先驗證FTY-720能否從基因水平改善絕經后骨質疏松動物模型的BMMSCs的成骨分化缺陷，然后通過針對Smad4基因設計siRNA序列構建慢病毒載體，感染骨質疏松動物模型的BMMSCs形成shRNA（Sahaorat haaiarapina RaNaA,短發(fā)夾樣RaNaA）穩(wěn)轉細胞株，抑制細胞內Smad信號通路中Smad4蛋白的表達從而阻斷Smad信號通路，再次驗證FTY-720能否在基因水平改善絕經

7、后骨質疏松動物模型的BMMSCs的成骨分化能力。初步探尋FTY-720促成骨作用的相關機制。為達此目的，本課題設計了以下研究內容。
　　研究內容：
　　1）建立去勢大鼠骨質疏松模型
　　SD大鼠首先分為兩組：去勢組（OVX）和假手術組（SHAM）。OVX組直接用外科手術方法將雌性SD大鼠雙側卵巢行卵巢切除術（ovariectomy，OVX），此組即是用來建立絕經后骨質疏松癥的動物模型組；另一SHAM組則在相同條件下只切

8、除卵巢周圍等量的脂肪組織。大約90天過后，分別對兩組大鼠進行稱重，并用Micro-CT掃描儀對骨密度（BMD）、骨小梁厚度指數（tarabaecualara tahaickanaesas,Tab.Tah）和骨小梁體積分數（baonae voaluamae fraactaioan,BaVF）進行測量，以鑒定大鼠骨質疏松動物模型是否建立成功。
　　2）不同濃度梯度FTY-720對OVX大鼠BMMSCs成骨分化的影響
　　動物模型

9、一旦確認構建成功，則利用全骨髓貼壁法結合酶消化時間控制的方法來分離純化rBMaMaSCas（rat BMaMSaCsa,大鼠骨髓間充質干細胞）。用倒置顯微鏡來觀察細胞形態(tài)，應用流式細胞技術來檢測細胞表面標記分子的表達，使用MaTaT法對細胞的增殖能力進行檢測，利用成骨、成脂誘導實驗檢測細胞的多向分化能力。
　　配制1nM、10nM、100nM三個濃度梯度的FTY-720成骨誘導液，對分別來自OVX組與SHAM組的rBMMSCs連續(xù)

10、誘導21天，在7、14、21天時檢測細胞成骨相關基因（Runx2、Sp7、OCN、ALP）mRNA的表達水平，在21天時檢測這些基因的蛋白表達水平，從而判斷細胞的成骨分化狀況。
　　3）慢病毒介導的Smad4基因沉默對FTY-720增強rBMMSCs成骨能力的影響
　　根據在基因庫里查詢到的大鼠Smad4的基因信息，使用Invitrogen在線siRNA序列設計軟件，設計合成3條針對目的基因CDS區(qū)的siRNA序列以及一條無

11、意義的亂序排列的siRNA-Negative序列作為對照組應用于實驗中。然后依照每條siRaNaA序列的堿基編碼，設計出互補的兩條DaNaA模板單鏈，再按照反應體系合成出相應的DNaA單鏈。DaNaA單鏈退火完成后，與shaRaNA質粒的表達載體（GaV11a2a Vecator）進行連接反應后送至基因公司進行基因測序。
　　將測序結果與設計相一致的shRNA1、shRNA2、shRNA3制備已經編碼慢病毒顆粒的重組病毒質粒載體p

12、GV-LV，重組病毒表達載體構建成功后，即對質粒的DNA進行去內毒素抽提；使用HEK-293T細胞接受shRNA病毒表達載體質粒的轉染，而后對病毒轉染效率進行觀察。釆用qRT-PCR和Westernblot的方法檢測293T細胞的Smad4基因被干擾后，其內源性Smad4基因的mRNA與蛋白質的表達水平以驗證干擾是否成功。再根據結果用干擾效率最高的shRNA2病毒轉染細胞株繼續(xù)下一步研究。在293T細胞內包裝和生產慢病毒顆粒的步驟完成后

13、，測定病毒滴度。按照梯度稀釋法以重組慢病毒顆粒過夜感染去勢組大鼠BMMSCs，篩選能夠達到有效感染效率（80%以上）的穩(wěn)轉細胞株。qRT-PCR和WesternBlot分別檢測去勢大鼠BMMSCs穩(wěn)轉細胞株內Smad4基因干擾和蛋白抑制的效率。
　　然后繼續(xù)用qRT-PCR和Westernblot的方法檢測10nMFTY-720誘導下去勢大鼠BMMSCs穩(wěn)轉株成骨相關基因與蛋白的表達情況，以評價Smad4基因靶向抑制對FTY-72

14、0促rBMMSCs-OVX成骨作用的影響。
　　4）慢病毒介導的Smad4基因沉默對去勢大鼠顱骨缺損模型在FTY-720促成骨作用下愈合質量的影響
　　首先用手術方法構建去勢大鼠顱骨直徑為7mm圓形缺損模型，用明膠海綿分別復合穩(wěn)轉細胞株（shRNA2慢病毒表達載體感染去勢大鼠BMMSCs穩(wěn)定沉默Smad4的轉染細胞）和正常的去勢大鼠BMMSCs（對照）充填于骨缺損處，5周后行Micro-CT掃描檢測顱骨缺損處骨形成情況，以評

15、價FTY-720對去勢大鼠的骨修復作用，以及靶向抑制了Smad4基因后此作用的消失。
　　研究結果
　?、傩g后3個月，兩組間大鼠體重、骨密度、骨小梁厚度指數及骨小梁體積分數均具有統(tǒng)計學差異。去勢組大鼠體重增加，股骨、脛骨骨密度、骨小梁厚度指數及骨小梁體積分數都降低。②體外采用全骨髓自然貼壁篩選法結合酶消化時間控制方法分離培養(yǎng)的rBMMSCs其形態(tài)大部分為長梭形或者多角形，可以長滿整個培養(yǎng)皿底，MTT曲線是典型的“S”形，且從

16、第4天開始OVX組BMMSCs的OD值高于SHAM組。細胞表面標志物為間充質標記物CD29，CD44，CD90和血管細胞黏附分子CD106呈現強陽性；造血干細胞標志物CD34和CD45呈陰性。并具有向成骨、成脂方向分化的能力，證明所培養(yǎng)的細胞是rBMMSCs。
　?、蹣嫿?nM,10nM,100nM三個濃度的FTY-720成骨誘導液分別對rBMMSCs-OVX（去勢組大鼠的BMMSCs）和rBMMSCs-SHAM（假手術組大鼠的

17、BMMSCs）進行了成骨誘導，這三組培養(yǎng)液均能使細胞的成骨相關基因（Runx2、Sp7、OCN、ALP）mRNA的表達和蛋白表達增高，其中以10nM組的最高，促進成骨能力最強。
　　④對作為表達載體的質粒GV112進行酶切線性化處理后與設計的3條siRNA成功進行了連接及轉化，制備出用于感染的4種shRNA質粒表達載體（包括用于對照的Negative組）。⑤對基因重組后的4種慢病毒質粒載體成功進行了慢病毒的包裝、感染和純化，qRT

18、-PCR和Western blot檢測結果顯示shRNA2的慢病毒表達載體干擾效率最高，所以選用以shRNA2序列為基礎的慢病毒顆粒構建rBMMSCs-OVX的穩(wěn)轉細胞株。
　　⑥成功構建了rBMMSCs-OVX+Lenti-shRNA2（LV-S2-OVX）的穩(wěn)轉細胞株。qRT-PCR和Westernblot檢測結果顯示LV-S2-OVX穩(wěn)轉細胞株的Smad4基因mRNA水平與蛋白水平均被明顯抑制。
　　⑦與對照組無意義序

19、列shRNA病毒感染細胞株相比（rBMMSCs-OVX+shRNA-Negative），10nM的FTY-720誘導液條件下LV-S2-OVX穩(wěn)轉細胞株的成骨相關基因（Runx2、Sp7、OCN、ALP）mRNA和蛋白的表達水平被明顯抑制。
　?、郙icro-CT掃描結果顯示無意義鏈病毒感染細胞株LV-Neg-OVX復合明膠海綿修復骨缺損，術區(qū)有較明顯新骨形成。而穩(wěn)轉細胞株（LV-S2-OVX）組的術區(qū)無新骨形成，骨缺損清晰可見。

20、
　　研究結論:
　　1）采用以全骨髓貼壁篩選法為基礎，結合酶消化時間的控制來分離培養(yǎng)rBMMSCs-OVX與rBMMSCs-SHAM這兩組細胞，其純化和擴增效果良好；再根據其生物學特性，以流式細胞術檢測的表型特征為參考，便能對rBMMSCs進行鑒定。而OVX手術本身不會改變rBMMSCs的表型特征。
　　2）1nM,10nM,100nM三個濃度的FTY-720都可以促進rBMMSCs-OVX的體外成骨分化能力，其中以

21、10nM的FTY-720促成骨分化能力最強。
　　3）構建的穩(wěn)轉細胞株（rBMMSCs-OVX+Lenti-shRNA2,LV-S2-OVX）對大鼠BMMSCs的Smad4基因的干擾效率高，穩(wěn)定性好。
　　4）抑制了Smad信號通路核心因子Smad4基因后，FTY-720的促成骨分化作用明顯降低，說明FTY-720的促成骨分化作用是通過Smad信號通路實現的。
　　5）體內實驗證實，抑制了Smad4基因，FTY-720