at-RA抑制大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的分子機(jī)制.pdf

1、目的探索全反式視黃酸(All-trans retinoic acid，at-RA)對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Rat bone marrow mesenchymal stem cells，rBMSCs)成骨分化的影響及其可能的分子機(jī)制。
　　材料與方法體外分離、培養(yǎng)3～4周齡SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，取第四代細(xì)胞開始成骨誘導(dǎo)分化，并用茜素紅染色進(jìn)行鑒定。向成骨誘導(dǎo)液中加入不同濃度(0.1、0.5、1.0、5.0μmol/L) at-R

2、A，實(shí)驗(yàn)分組為:空白對(duì)照組（未加成骨分化培養(yǎng)基）、對(duì)照組（未加at-RA）、0.1、0.5、1.0、5.0μmol/L at-RA處理組。取誘導(dǎo)7天的細(xì)胞用組織化學(xué)染色法和堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)活性變化;取誘導(dǎo)21天的細(xì)胞用茜素紅染色及提取法檢測(cè)各組細(xì)胞鈣鹽沉積水平;Real-time PCR動(dòng)態(tài)檢測(cè)在5.0μmol/L at-RA作用不同時(shí)間后（誘導(dǎo)第7、14、21天

3、）細(xì)胞骨鈣素(osteocalcin，OCN)、骨橋素(osteopontin，OPN)mRNA水平，同樣的方法在誘導(dǎo)第1、3、7、14、21天檢測(cè)成骨信號(hào)通路上Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)、成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Osterix)以及視黃酸信號(hào)通路相關(guān)受體RARα、RARβmRNA水平的變化。
　　結(jié)果(1) rBMSCs在成骨培養(yǎng)基誘導(dǎo)下成骨效應(yīng)顯著。(2)細(xì)胞形態(tài)及茜素紅染色觀察發(fā)現(xiàn):向成骨誘導(dǎo)液中加入不同濃度at-RA后

4、，成骨分化受到明顯抑制，與對(duì)照組相比，鈣化結(jié)節(jié)出現(xiàn)時(shí)間較晚，鈣鹽沉積量少。(3)加入at-RA后培養(yǎng)第7天，ALP活性較對(duì)照組增加，進(jìn)一步做兩組間比較發(fā)現(xiàn)，除0.1μmol/L at-RA組外，其他經(jīng)at-RA處理后的三組ALP活性均高于對(duì)照組（Pblank vs。0。5μmol/L at-RA=0.011，Rblank vs。1.0μmol/L at-RA=0.000，Pblank vs。5.0μmol/Lat-RA=0.000）;然

5、而經(jīng)茜素紅染色測(cè)定，ALP升高組其鈣鹽沉積與對(duì)照組比較反而減少，除0.1μmol/L at-RA組外，其他三組均低于對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Pblank vs。0。5μmol/L at-RA=0.025，Pblank vs。1.0μmol/L at-RA=0.002,Pblank vs。5.0μmol/Lat-RA=0.000）。選at-RA濃度5.0μmol/L做real-time PCR檢測(cè)，與對(duì)照組相比在上述3個(gè)時(shí)間點(diǎn)(第7、14、

6、21天)OCN(F=211.145,P=0.000)、OPN(F=30.835,P=0.005)表達(dá)均降低，第21天Runx2（F=106.536，P=0.000）、Osterix(F=452.546，P=0.000)、RARα（F=253.159，P=0.000）表達(dá)均下降，除Osterix表現(xiàn)為全程下調(diào)外，其他2個(gè)基因也在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)有顯著性差異;而RARβ表達(dá)則表現(xiàn)為全程明顯上升（F=2294.377，P=0.000）。