siRNA特異性及脫靶效應(yīng)的研究.pdf

1、RNA干擾(RNA interfering,RNAi)是指進(jìn)化保守的小干擾RNA(smallinterfering RNA,siRNA)介導(dǎo)的抑制靶基因表達(dá)的現(xiàn)象。主要通過(guò)降解靶標(biāo)mRNA從而抑制目標(biāo)蛋白合成的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,有效抑制基因表達(dá)。參與這一過(guò)程的作用因子是siRNA(約21-23nt),作為關(guān)鍵的媒介與RISC蛋白在細(xì)胞質(zhì)中結(jié)合,進(jìn)而特異性的降解靶標(biāo)mRNA。由于siRNA的這種特性可以抑制致病基因的突變位點(diǎn),因此siRNA被廣

2、泛希望于作為新一代的生物臨床治療藥物。
　　 RNA干擾過(guò)程中,siRNA和mRNA特異結(jié)合能夠使得靶基因沉默。但研究證實(shí),siRNA還可以與非靶基因結(jié)合而導(dǎo)致非靶基因沉默,這種現(xiàn)象稱為siRNA的脫靶效應(yīng)。
　　 siQuant系統(tǒng)以雙熒光報(bào)告檢測(cè)技術(shù)為基礎(chǔ),是一種檢測(cè)siRNA抑制活性的高通量檢測(cè)工具。在siQuant中引入siRNA的靶位點(diǎn),siRNA的沉默效率可以通過(guò)熒光報(bào)告基團(tuán)的活性直接反映出來(lái)。
　　

3、 siRNA的沉默特異性和脫靶效應(yīng)是其作為臨床應(yīng)用,特別是在選擇性沉默SNP突變基因過(guò)程中遇到的關(guān)鍵問(wèn)題。然而,目前尚沒(méi)有設(shè)計(jì)等位基因特異性siRNA的可行性指導(dǎo)原則。本論文以基于siQuant的雙熒光報(bào)告系統(tǒng)為主要檢測(cè)手段,使用20條siRNAs和相應(yīng)的240條錯(cuò)配靶序列,以siRNA的4、12和17三個(gè)位點(diǎn)為例,發(fā)現(xiàn)siRNA的錯(cuò)配容忍模式是由其錯(cuò)配位點(diǎn)決定的,在不同位置具有不同的錯(cuò)配容忍模式,并且不受周圍序列的影響。本論文進(jìn)一步使

4、用20條siRNAs和相應(yīng)的260條錯(cuò)配靶序列對(duì)siRNA的錯(cuò)配模式進(jìn)行了全面研究,建立了siRNA各堿基在各位點(diǎn)的錯(cuò)配容忍模式圖譜。
　　 根據(jù)上述得到的siRNA各堿基各位點(diǎn)錯(cuò)配容忍規(guī)律,將錯(cuò)配位點(diǎn)放置在siRNA高敏感區(qū)域,從而實(shí)現(xiàn)將完全匹配與單堿基錯(cuò)配選擇性地沉默,即通過(guò)人為設(shè)計(jì)等位基因特異性siRNA來(lái)有效抑制突變治病的等位基因而對(duì)正?；虻挠绊戇_(dá)到最小。本論文設(shè)計(jì)抑制PIK3CA基因的兩個(gè)致病突變位點(diǎn)的特異性siRN