實(shí)時(shí)熒光PCR在基因分型與稀有突變檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、基因多態(tài)性是人類群體中的常見現(xiàn)象，這些差別可能在某些條件下導(dǎo)致人類疾病?？焖?、準(zhǔn)確地對(duì)基因多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)對(duì)于疾病預(yù)防與控制十分重要。腫瘤等疾病往往伴有多種體細(xì)胞突變，成為腫瘤監(jiān)測(cè)、預(yù)后等生物標(biāo)志，或靶向藥物的靶點(diǎn)以及反應(yīng)性標(biāo)志。不過(guò)體細(xì)胞突變一般是稀有突變，較難檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)技術(shù)要求極高。本論文憑借實(shí)時(shí)PCR技術(shù)平臺(tái)，利用雙鏈熒光置換探針、ARMS引物、PAP引物、高分辨溶解曲線分析等不同策略，檢測(cè)不同的突變。論文前三章針對(duì)基因多態(tài)性檢測(cè)

2、，第四章針對(duì)稀有突變檢測(cè)。 第1章血小板血型抗原的基因分型本章利用熒光雙鏈置換探針，以臨床上6個(gè)主要的HPA系統(tǒng)的12個(gè)抗原為研究對(duì)象，建立相應(yīng)的基因分型方法。首先針對(duì)各個(gè)HPA系統(tǒng)建立了單重實(shí)時(shí)PCR，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程僅需100min，具有特異性好、快速簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。進(jìn)一步發(fā)展的3個(gè)四色實(shí)時(shí)PCR體系只需3個(gè)PCR管就能對(duì)6個(gè)HPA系統(tǒng)的12個(gè)等位基因同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，共用同一個(gè)PCR程序，使檢測(cè)更加簡(jiǎn)便、高效。第一個(gè)四色實(shí)時(shí)PCR體系

3、能同時(shí)對(duì)HPA-1和-4進(jìn)行檢測(cè)；第二個(gè)四色實(shí)時(shí)PCR體系能同時(shí)對(duì)HPA-2和-3進(jìn)行檢測(cè)；第三個(gè)四色實(shí)時(shí)PCR體系能同時(shí)對(duì)HPA-5和-15進(jìn)行檢測(cè)。用所建立的四色實(shí)時(shí)PCR技術(shù)檢測(cè)了150份廈門健康獻(xiàn)血者樣品，結(jié)果與對(duì)照方法一致，并統(tǒng)計(jì)了廈門人群6個(gè)基因座位的基因頻率，與此前報(bào)道的中國(guó)人群基因頻率相近。 第2章ABO血型基因分型本章利用熒光雙鏈置換探針，以ABO血型系統(tǒng)為研究對(duì)象，建立相應(yīng)的基因分型方法。根據(jù)ABO基因結(jié)構(gòu)特

4、點(diǎn)，設(shè)計(jì)7條特異性雙鏈熒光置換探針分別檢測(cè)O1(261delG)，A(261G)，A(796C/803C)，B(796A/803C)，O2(802G＞A)，A2(1059delC)，A2(1009A＞G)，并建立單管或雙管兩種檢測(cè)模式。單管檢測(cè)模式可根據(jù)四種熒光信號(hào)的組合，判斷ABO血型的4個(gè)表型和6種基因型；雙管檢測(cè)模式可根據(jù)7個(gè)熒光探針產(chǎn)生的熒光信號(hào)變化組合，判斷ABO血型的15種基因型。單管檢測(cè)模式靈敏度可達(dá)160pg的基因組DN

5、A，在0.16～500ng范圍有良好的線性關(guān)系，對(duì)已知表型的110份樣品進(jìn)行了基因定型，并對(duì)134份樣品進(jìn)行了盲測(cè)。檢測(cè)結(jié)果與PCR-SSP檢測(cè)結(jié)果一致，與已知的血型表型基本一致。雙管檢測(cè)模式對(duì)已知表型的110份樣品進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與PCR—SSP檢測(cè)結(jié)果一致。樣品中檢測(cè)到1份稀有的O1O1V—B樣品。單管檢測(cè)模式盲試中有1份與記錄的表型不符，后經(jīng)測(cè)序和PCR—SSP方法證明檢測(cè)結(jié)果正確。 第3章HLA—B27實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)

6、本章利用熒光雙鏈置換探針，以與強(qiáng)直性脊柱炎相關(guān)的HLA—B27抗原為研究對(duì)象，建立相應(yīng)的基因檢測(cè)方法。反復(fù)比對(duì)了HLA—B基因座位所有等位基因外顯子2和3序列，選出B27相對(duì)保守又與其他B抗原基因差別較大的區(qū)域，設(shè)計(jì)特異性引物和兩條特異性雙鏈熒光置換探針，涵蓋了所有已報(bào)道的35個(gè)亞型(截至2007年2月)。在體系中加入HGH基因檢測(cè)體系作為內(nèi)控，預(yù)示PCR反應(yīng)體系和DNA模板提取質(zhì)量，排除假陰性。對(duì)362份中國(guó)人的臨床樣品進(jìn)行了基因檢測(cè)

7、并與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了比較。362份樣品中，359份樣品所得結(jié)果一致，3份不符，符合率為99％；流式檢測(cè)164份陽(yáng)性，198份陰性；實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)165份陽(yáng)性，197份陰性。 第4章非小細(xì)胞肺癌吉非替尼藥物反應(yīng)性EGFR稀有突變檢測(cè)本章利用ARMS引物、雙鏈熒光PAP引物、高分辨熔解曲線分析、以及熒光雙鏈置換探針，以非小細(xì)胞肺癌吉非替尼藥物反應(yīng)性有關(guān)的29種EGFR突變?yōu)檠芯繉?duì)象，建立相應(yīng)的4種檢測(cè)方法，相互比較每種方法的

8、檢測(cè)能力，選出檢測(cè)能力最佳成本最低的檢測(cè)方法，最后進(jìn)行臨床樣品的檢測(cè)。ARMS引物法對(duì)熱點(diǎn)突變等大多數(shù)突變可以檢測(cè)到0.1％，其他突變可以檢測(cè)到1％；雙鏈熒光PAP引物對(duì)3個(gè)熱點(diǎn)突變均可以檢測(cè)到0.1％，對(duì)19—M1可以檢測(cè)到0.01％；高分辨熔解曲線分析法對(duì)4個(gè)外顯子的29種突變中的23個(gè)能夠有效檢測(cè)，檢測(cè)能力在1～10％之間；熒光雙鏈置換探針法在對(duì)19種缺失突變檢測(cè)中，對(duì)19—M1的檢測(cè)能力可達(dá)到1％，對(duì)其他缺失突變檢測(cè)能力在5～1