CX43蛋白磷酸化在大鼠逼尿肌過度活動癥中的作用.pdf

1、目的:
　　逼尿肌過度活動癥(DO)是一種常見的臨床疾病，其膀胱興奮性通常高于正常膀胱。DO的主要癥狀是:尿急、尿頻、伴有或者不伴有尿失禁。DO的發(fā)病機制仍不清楚，且治療困難。膀胱出口部分梗阻(PBOO)是DO的主要病因，其機制可能涉及到神經(jīng)源性和肌源性的因素。最近一些研究表明，細胞間通訊的改變被認為是DO發(fā)病的機制之一，CX43蛋白可能在DO的發(fā)病過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。與正常組相比較，DO組的細胞間通訊的功能（Gap junct

2、ion intercellular communication，GJIC）和CX43蛋白的表達都明顯增加。
　　CX43蛋白是一種磷蛋白，其磷酸化的狀態(tài)會影響細胞間通訊功能。但是CX43蛋白的磷酸化在DO的發(fā)病過程中的作用仍然不清楚。
　　在我們的試驗中，我們通過建立DO模型來評價CX43蛋白的磷酸化在大鼠DO中的作用，并且初步探索蛋白磷酸酶1(PP1)和蛋白磷酸酶2A(PP2A)在CX43蛋白磷酸化中的作用。
　　方

3、法:
　　1.建立DO模型:實驗動物為60只雌性大鼠(150克-180克)。大鼠采用腹腔注射戊巴比妥鈉(2％)進行麻醉，其中40只進行膀胱出口梗阻的手術(shù)。6周后，通過尿動力學(xué)評估篩選合格的大鼠納入到DO組。假手術(shù)組的大鼠被納入到正常組。
　　2.Western bloting:提取蛋白。然后蛋白(50ug)通過SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移到纖維素膜上。用5％的BSA對膜進行封閉。孵育CX43多克隆抗體、PP1抗體、PP

4、2抗體和β-actin的一抗。然后孵育結(jié)合有辣根過氧化酶的二抗。通過ChemiDoc XRS+Image系統(tǒng)顯示標(biāo)記過的蛋白。
　　3.免疫熒光雙染:將膀胱組織做冰凍切片，切好的組織粘附在防脫片載玻片上，4％的多聚甲醛(PH7.4)固定30分鐘。組織切片用1％胎牛血清白蛋白在室溫情況下封閉2小時，然后4℃孵育CX43單克隆抗體、CX43多克隆抗體、PP1抗體和PP2A抗體12小時。PBS清洗后，室溫下孵育結(jié)合有異硫氰酸四甲基羅丹明

5、(Tetramethylrhodamineisothiocyanate， TRITC)和異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)的二抗1小時。PBS清洗切片。然后用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(4，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)室溫下染核10分鐘。最后組織切片用激光共聚焦顯微鏡檢測。
　　4.分離原代膀胱平滑肌細胞:將取出的膀胱放入37℃的消化酶(5ml)

6、中，剪成約1毫米的碎塊。消化酶的成分為:2.0mg/ml的膠原酶Ⅱ、2.0mg/ml的BSA，2.0mg/ml的胰酶抑制劑。碎塊消化約35分鐘，然后用含10％胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化。離心5分鐘（1200轉(zhuǎn)/分鐘），棄上清。加入含DMEM、10％胎牛血清和1％鏈霉素-青霉素的培養(yǎng)基。滴管吹打約300次.200目篩子(0.22um)過濾細胞，然后將濾液轉(zhuǎn)入小培養(yǎng)皿中。細胞放入孵箱（37℃，95％O2和5％ CO2）中培養(yǎng)。
　　5.

7、熒光漂白恢復(fù)實驗（Fluorescent bleaching recovery experiments，F(xiàn)RAP）:將貼壁好的細胞用PBS清洗一遍，然后把含有6-羧基二乙酸熒光素(6-Carboxyfluorescein diacetate，6-CFDA;10U/ml)的培養(yǎng)基加入到小皿中對細胞進行染色。孵箱中染色30分鐘，而后PBS清洗三次。正常組和DO組加入正常的培養(yǎng)基，DO+AP組加入含堿性磷酸酶(AP)的培養(yǎng)基。選擇合適的細胞進

8、行淬滅。實時記錄漂白前和漂白后5分鐘的影像圖片。
　　結(jié)果:
　　1.成功的建立了DO模型。共23只大鼠被納入到了DO組;
　　2.與正常組相比較，CX43蛋白的各個亞基的表達均明顯增加，PP2A的表達降低，PP1的表達沒有明顯變化;
　　3.DO組細胞間通訊的功能明顯強于正常組，DO+AP組的細胞間通訊的功能明顯低于正常組和DO組。
　　結(jié)論:
　　1.CX43蛋白磷酸化水平的增加在DO的發(fā)病過程中