Cx43及Cx43-hemichannel在大鼠全腦缺血再灌注損傷中的作用.pdf

1、研究背景:
　　 腦血管病(cerebrovasculardisease，CVD)以突發(fā)性神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙為特點(diǎn)，臨床多表現(xiàn)為急性偏癱、失語(yǔ)、驚厥、意識(shí)障礙、顱內(nèi)壓增高等，是導(dǎo)致人類(lèi)死亡的三大主要疾病之一。根據(jù)病理特點(diǎn)，可分為缺血性和出血性?xún)纱箢?lèi)，其中缺血性占絕大多數(shù)。臨床上，腦梗死、心肌梗死、休克、新生兒窒息、新生兒缺氧缺血性腦病、腦外傷等都可引起腦缺血性損害。對(duì)腦缺血的研究目前有成熟的體內(nèi)、體外模型，體內(nèi)模型有全腦缺血模型和

2、局灶性腦缺血模型，體外模型主要為單純?nèi)毖跄Ｐ秃脱跆莿儕Z模型，但各模型都無(wú)法完全模擬人類(lèi)復(fù)雜的腦缺血病理過(guò)程。目前對(duì)缺血性腦血管病的研究主要集中在再灌注損傷對(duì)最終梗死灶體積的影響方面，普遍認(rèn)為再灌注損傷以細(xì)胞凋亡為主。對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的研究中大多以神經(jīng)元為主，而對(duì)數(shù)量龐大、作用廣泛的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞涉及很少。
　　 半胱氨酸天冬酶-3(Cysteinylaspartate-specificprotease-3，Caspase-3)是目前

3、研究較多和比較明確的一種凋亡因子，是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游最關(guān)鍵的蛋白酶，是各種因素啟動(dòng)的凋亡程序的必經(jīng)之路。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)腦損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞可表達(dá)Caspase-3，其表達(dá)量與凋亡指數(shù)呈正比，提示Caspase-3亦與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞凋亡有關(guān)。
　　 縫隙連接(gapjunction，GJ)是相鄰細(xì)胞間的跨膜通道，由相鄰細(xì)胞膜上的兩個(gè)半通道(hemichannels)相互錨定組成?？p隙連接蛋白(connexin，Cx)是這兩種通道的

4、結(jié)構(gòu)蛋白，Cx43是Cx家族中數(shù)量最為豐富的成員，且已證實(shí)Cx43在人及大鼠的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中存在?？p隙連接能在細(xì)胞間傳輸毒性代謝產(chǎn)物和能量，其可能對(duì)腦損傷的擴(kuò)散或修復(fù)有影響。已發(fā)現(xiàn)使用縫隙連接阻斷劑可減輕腦缺血或缺血再灌注引起的腦損傷，減小梗死面積。但從基因方面抑制縫隙連接形成反而使細(xì)胞或組織更易受損。因此，縫隙連接對(duì)腦損傷是否起保護(hù)作用仍存在爭(zhēng)論，可能與縫隙連接阻斷劑缺乏特異性有關(guān)。近來(lái)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜上未配對(duì)的半通道是可以單獨(dú)存在的，并在

5、許多病理生理情況下開(kāi)放，其開(kāi)放可致細(xì)胞凋亡及腦損傷加重。越來(lái)越多研究證明縫隙連接及半通道與創(chuàng)傷愈合、心肌梗死、心律失常、腦梗死、癲癇、腫瘤等都有密切關(guān)系。縫隙連接蛋白(Cx)的研究主要集中在線(xiàn)粒體、細(xì)胞核中的Cx對(duì)細(xì)胞死亡及增殖的抑制，相關(guān)機(jī)制仍不十分明確。
　　 既然縫隙連接、半通道都與腦損傷相關(guān)，二者的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)Cx又與細(xì)胞死亡有關(guān)，而神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的存亡決定腦損傷的預(yù)后，我們考慮可以從Cx、縫隙連接及半通道入手，研究三者對(duì)神經(jīng)

6、膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響及在缺血再灌注損傷中的作用。因此，我們選擇大鼠全腦缺血再灌注模型，檢測(cè)再灌注期間Caspase-3、Cx43及Cx43-hemichannel(Cx43-hcl)蛋白的表達(dá)變化（其中對(duì)Cx43-hemichannel表達(dá)的檢測(cè)國(guó)內(nèi)鮮有報(bào)道），證明Cx43及Cx43-hemichannel可能通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞凋亡而參與腦缺血再灌注損傷，為缺血性腦血管病的臨床治療提供新的理論依據(jù)。
　　 目的:
　　

7、研究大鼠全腦缺血再灌注損傷致半胱氨酸天冬酶-3(Caspase-3)、縫隙連接蛋白43(Connexin43，Cx43)及其半通道蛋白(Cx43-hemichannel)的表達(dá)變化，探討Cx43及Cx43-hemichannel在腦缺血再灌注損傷中的作用，為腦缺血的治療尋找新的理論基礎(chǔ)和治療手段。
　　 方法:
　　 健康成年雄性Wistar大鼠56只（造模失敗后補(bǔ)充動(dòng)物），體重270-320g，隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sha

8、m組）、全腦缺血10min再灌注0.5h組（IR/0.5h組）、全腦缺血10min再灌注6h組(IR/6h組)、全腦缺血10min再灌注24h組(IR/24h組），每組14只動(dòng)物，8只用于免疫熒光組化，6只用于免疫印跡(Westernblot)。采用改良的Pulsinelli四血管閉塞法(4-V0)制作大鼠全腦缺血再灌注模型，各組大鼠在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)斷頭取腦，分別采用免疫熒光組織化學(xué)方法和免疫印跡方法檢測(cè)各組大鼠側(cè)腦室室下區(qū)(thesubv

9、entricularzone，SVZ)Caspase-3、Cx43和Cx43-hemichannel的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.動(dòng)物模型制備56只成年雄性Wistar大鼠中全腦缺血再灌注模型制備成功47只（造模失敗后補(bǔ)充動(dòng)物），成功率84％，9只造模失敗的大鼠中死亡4只（麻醉意外2只，手術(shù)過(guò)程中出現(xiàn)誤吸1只，分離頸總動(dòng)脈時(shí)造成大出血1只），不符合模型標(biāo)準(zhǔn)5只（未出現(xiàn)瞳孔變大3只，術(shù)中或術(shù)后出現(xiàn)驚厥樣抽搐2只）;

10、
　　 2.免疫熒光組織化學(xué)方法顯示假手術(shù)組見(jiàn)極少量Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)，少量Cx43和Cx43-hemichannel陽(yáng)性表達(dá)，在全腦缺血10min再灌注0.5h時(shí)各蛋白陽(yáng)性表達(dá)開(kāi)始增加，但與假手術(shù)組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），于再灌注6h和24h時(shí)各蛋白陽(yáng)性表達(dá)明顯增加，以24小時(shí)為著，與假手術(shù)組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;
　　 3.免疫印跡法顯示Caspase-3、Cx43和Cx43

11、-hemichannel蛋白表達(dá)于全腦缺血10min再灌注0.5h時(shí)開(kāi)始升高，但與假手術(shù)組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），于再灌注6h和24h時(shí)各蛋白陽(yáng)性表達(dá)明顯增加，以24小時(shí)為著，與假手術(shù)組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 腦缺血再灌注損傷可致神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生凋亡，Cx43及Cx43-hemichannel在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞凋亡過(guò)程中起到了促進(jìn)作用，可能是缺血再灌注損傷發(fā)生及發(fā)展的機(jī)制