NGF調控CGRP表達促進MG-63細胞增殖分化的實驗研究.pdf

1、目的：
　　口腔頜面部因為腫瘤或者外傷造成的骨創(chuàng)傷和組織缺損一直是臨床的難點。隨著中國社會的飛速發(fā)展，口腔頜面部交通傷逐年增多，同時現(xiàn)代戰(zhàn)爭中對于頜面部的防護不足，造成戰(zhàn)創(chuàng)傷中頜面部傷的發(fā)生率達全身傷10％以上。因此，創(chuàng)傷修復機制的研究一直是基礎和臨床研究的熱點。
　　骨創(chuàng)傷修復和愈合經歷血腫形成，血腫機化，纖維骨痂的形成等一系列過程，包括免疫系統(tǒng)的參與，血管的生成和改建，成骨細胞的生成和募集。是一個由多細胞和多生長因子參與

2、調控的復雜過程，在此過程中既有成骨細胞和成骨相關細胞分泌的細胞因子的調控作用，也有其他細胞通過旁分泌途徑產生的各種激素和調節(jié)因子的作用。大量的實驗證明周圍神經系統(tǒng)分泌的神經肽類物質在骨創(chuàng)傷修復中有著重要的生物學意義，降鈣素基因相關肽(calcitonin gene related peptide，CGRP)，因在骨創(chuàng)傷愈合中發(fā)揮的至關重要的調控作用而受到廣泛關注。在體內實驗中通過基因敲除小鼠和轉基因小鼠證明的CGRP具有明顯的成骨正效應

3、;體外實驗中發(fā)現(xiàn)CGRP有促進成骨細胞(Osteoblast，OB)增殖作用，因而CGRP成為骨創(chuàng)傷愈合研究中的熱點和主體。但近年來的研究發(fā)現(xiàn)神經系統(tǒng)也參與到骨創(chuàng)傷的修復和重建中，其中神經生長因子(nervegrowth factor，NGF)是神經營養(yǎng)因子家族(neurotrophic factor; neurotrophic factors，NTF)的重要成員，存在于骨形成細胞中，通過上調成骨細胞活性，引導神經長入骨痂來促進骨的愈合

4、。CGRP由神經末梢釋放作用于靶細胞，而NGF由神經靶細胞釋放，被神經末梢攝取，兩者都具有明顯的促成骨效應，兩者是否有相互之間的信號聯(lián)系和調節(jié)機制報道少見。
　　本實驗基于以上想法，體外培養(yǎng)成骨肉瘤細胞株MG-63細胞，通過NGF干預MG-63細胞，檢測CGRP的表達狀況，探討NGF對骨修復過程中對CGRP的影響，以及對MG-63增殖和分化的作用，旨在加深對骨創(chuàng)傷愈合機制的認識，為臨床頜骨骨創(chuàng)傷愈合治療方法提供相關理論依據(jù)。

5、>　　方法:
　　1.細胞培養(yǎng):
　　人骨肉瘤細胞株MG-63細胞株購買于ATCC公司，以8×106/瓶密度接種于100ml培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)傳代，加入含10％ FCS的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于5％ CO2孵箱中37℃孵育48傳代，3-5代細胞用于實驗。
　　2.NGF對MG-63細胞增殖分化的調控作用。
　　2.1.MG-63細胞增殖:ELISA法檢測NGF刺激MG-63細胞后CGRP表達;Q-PCR法測CGRP m

6、RNA表達;CCK-8法測MG-63細胞增殖。NGF濃度(0-100 ng/ml)，時效作用(1-4d)。
　　2.2.MG-63細胞分化:PNPP偶氮法檢測NGF對MG-63細胞ALP染色的調控作用(100 ng/ml);茜素紅染色檢測NGF對MG-63鈣化結節(jié)的量效作用(100 ng/ml)。
　　2.3.MG-63細胞中加入NGF受體阻斷劑(PD98059): Q-PCR法測CGRP mRNA表達;CCK-8法測MG-

7、63細胞增殖。NGF濃度(0-100 ng/ml)，時效作用(1-4d)。
　　3.MG-63細胞過表達NGF對CGRP的表達作用，以及對成骨標志物的表達作用。
　　MG-63細胞過表達NGF:RT-PCR，Western-blot檢測CGRP以及MG-63細胞中ALP、CollagenⅠ的表達。時效作用(1-5d)。
　　結果:
　　1.NGF對MG-63細胞增殖分化的調控作用。
　　1.1.MG-63細

8、胞增殖:ELISA檢測發(fā)現(xiàn)MG-63細胞自身可以產生少量的CGRP，在NGF作用下，可以明顯上調MG-63細胞分泌的CGRP(p＜0.05)，而且隨NGF濃度升高，CGRP有明顯的濃度依賴性。
　　MG-63細胞上清液中CGRP的濃度隨不同濃度的NGF作用時間延長也相應增加(p＜0.05)。RT-QPCR檢測發(fā)現(xiàn)在NGF作用下，可以明顯上調MG-63細胞分泌的CGRPmRNA(p＜0.05)，而且隨加入的NGF濃度升高，此作用也相

9、應增強。此外，MG-63細胞總RNA中CGRPmRNA的濃度隨不同濃度的NGF作用時間延長也相應增加(p＜0.05)。
　　CCK-8法檢測發(fā)現(xiàn)加入NGF阻斷劑后的干擾組的MG-63細胞增殖效率明顯低于其余兩組(p＜0.05)，而實驗組加入NGF刺激后MG-63細胞增殖效率明顯高于空白對照組(p＜0.05)，而且隨加入的NGF濃度升高，此作用也相應增強。此外實驗組NG-63細胞增殖效率隨不同濃度的NGF作用時間延長也相應增加(p＜

10、0.05)。
　　1.2.MG-63細胞分化:PNPP偶氮法檢測發(fā)現(xiàn)NGF刺激MG-63細胞的ALP表達量明顯高于空白對照組(p＜0.05);茜素紅染色檢測發(fā)現(xiàn)NGF刺激MG-63細胞茜素紅染色計數(shù)高于對照組（P＜0.05）。
　　1.3.MG-63細胞中加入NGF受體阻斷劑:RT-QPCR檢測發(fā)現(xiàn)在加入NGF阻斷劑后，可以明顯降低MG-63細胞分泌的CGRPmRNA(p＜0.05)，而且隨加入的NGF濃度升高，此作用也相應

11、增強。此外在3d為NGF阻斷劑干擾時間的峰值(p＜0.05)。
　　2.MG-63細胞過表達NGF對CGRP的表達作用，以及對成骨標志物的表達作用。
　　MG-63細胞過表達NGF:NGF過表達的慢病毒及空載體慢病毒轉染MG-63細胞后Real-time PCR結果顯示ALP、CollagenⅠ和CGRP的mRNA濃度比空載體組明顯升高(p＜0.05），且隨著NGF作用時間延長也相應增加(p＜0.05)。NGF過表達的慢病毒

12、及空載體慢病毒轉染MG-63細胞后WB結果顯示ALP、CollagenⅠ和CGRP的表達量比空載體組顯著升高(p＜0.05），且隨著NGF作用時間延長也相應增加(p＜0.05)。
　　結論:
　　1.MG-63細胞自身可以產生少量的CGRP，在NGF作用下可以明顯上調MG-63細胞分泌的CGRP的表達量，而且隨NGF濃度升高，CGRP有明顯的濃度和時間依賴性。
　　2.通過對NGF的信號阻斷可以有效抑制CGRP的表達，