TIEG1誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的相關(guān)研究.pdf

1、目的：
　　TIEG1是TGF-β1誘導(dǎo)的早期反應(yīng)基因(TGF-β1 inducible early gene，TIEG1)，作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)節(jié)多種與細(xì)胞生長(zhǎng)分化有關(guān)的基因的表達(dá)。TIEG1的生物學(xué)功能仍未完全闡明，目前的研究認(rèn)為T(mén)IEG1主要的生物學(xué)功能是抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡。TIEG1的這一功能主要與TGF-β/Smad信號(hào)通路有關(guān)。
　　Smads蛋白家族是一個(gè)在脊椎動(dòng)物、昆蟲(chóng)和線(xiàn)蟲(chóng)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子家族，它是

2、迄今為止唯一已被證明的TGF-β受體作用的底物。在哺乳動(dòng)物中，發(fā)揮主要作用的Smads蛋白是Smad2、Smad3、Smad4和Smad7。
　　Bcl-2家族基因廣泛分布于生物體中。據(jù)其在細(xì)胞凋亡調(diào)控中的不同作用，Bcl-2蛋白家族分為抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白。Bcl-2與Bax基因均屬于Bcl-2家族，它們分別是Bcl-2家族中最有代表性的抑制凋亡和促進(jìn)凋亡基因，在腫瘤細(xì)胞凋亡中具有重要的調(diào)控作用。
　　TIEG1過(guò)表達(dá)可

3、抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，TIEG1異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，在惡性腫瘤組織中TIEG1的表達(dá)降低，如乳腺癌、胰腺癌、肝癌等。這些研究結(jié)果表明，TIEG1可能是一個(gè)重要的腫瘤抑制因子，TIEG1過(guò)表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡，因此有必要對(duì)其進(jìn)行深入研究。
　　目前，TIEG1對(duì)血液腫瘤細(xì)胞的相關(guān)研究少見(jiàn)。有研究表明，在某些抗癌藥物誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡過(guò)程中，TIEG1的表達(dá)明顯上調(diào)。說(shuō)明TIEG1可能是白血病

4、細(xì)胞的抑制因子，與白血病細(xì)胞的凋亡相關(guān)。
　　本研究通過(guò)探討TIEG1對(duì)白血病細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用，期望明確TIEG1誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，為白血病的治療尋找新靶點(diǎn)。
　　方法：
　　1、K562、Raji、U937、HL-60細(xì)胞株培養(yǎng)。
　　2、TIEG1以0ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml濃度分別作用于白血病細(xì)胞，MTT法檢測(cè)細(xì)胞加藥后0h、6h、12h、24h、

5、48h的增殖抑制率。
　　3、選擇siRNA片段及作用時(shí)間，轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞，沉默TIEG1表達(dá)。
　　4、流式細(xì)胞儀測(cè)定加藥后0h、6h、12h、24h、48h的細(xì)胞凋亡率。
　　5、RT-PCR檢測(cè)加藥后0h、6h、12h、24h、48h各時(shí)間點(diǎn)Smad2、Smad3、Smad4和Smad7及Bcl-2、Bax的RNA水平。
　　6、建立HL-60白血病小鼠模型:分為A、B、C、D4組，A組為對(duì)照組，B、C

6、、D組小鼠尾靜脈注射HL-60細(xì)胞。建模后每天觀(guān)察小鼠狀態(tài)，每周取小鼠尾靜脈外周血涂片觀(guān)察白細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)。對(duì)HL-60白血病小鼠模型進(jìn)行藥物處理:A、B組小鼠經(jīng)尾靜脈注射等體積生理鹽水，C組小鼠經(jīng)尾靜脈注射TIEG1（25ug/kg/d，每天1次，共注射14天），D組小鼠經(jīng)尾靜脈注射TIEG1（100ug/kg/d，每天1次，共注射14天）。14天后，處死各組小鼠，分離雙側(cè)股骨，留取骨髓細(xì)胞，完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　7、提取動(dòng)物模型

7、各組細(xì)胞，以Western blot方法檢測(cè)Smad2、Smad3、Smad4、Smad7、Bcl-2、Bax表達(dá)的蛋白水平。
　　結(jié)果：
　　1、TIEG1對(duì)K562 Raji、U937白血病細(xì)胞具有增殖抑制作用，其抑制效應(yīng)呈時(shí)間及劑量依賴(lài)性(P＜0.05)。以10ng/ml的TIEG1作用于K562、Raji、U937白血病細(xì)胞?？梢杂^(guān)察到各組白血病細(xì)胞在6h、12h、24h、48h均出現(xiàn)不同程度的凋亡，呈時(shí)間依賴(lài)性。<

8、br>　　2、TIEG1對(duì)HL-60細(xì)胞具有增殖抑制作用，其抑制效應(yīng)呈時(shí)間及劑量依賴(lài)性(P＜0.05)。求得IC50:71.321ng/ml(6h),54.77ng/ml(12h),12.03ng/ml(24h)，8.45ng/ml(48h)。以12.03ng/ml的TIEG1作用于HL-60細(xì)胞，可以觀(guān)察到細(xì)胞在6h、12h、24h、48h均出現(xiàn)不同程度的凋亡，呈時(shí)間依賴(lài)性。以12.03ng/ml的TIEG1作用于HL-60細(xì)胞，分別

9、檢測(cè)用藥后0h、6h、12h、24h、48h各時(shí)間點(diǎn)，Smad2、Smad3、Smad4、Smad7及Bax表達(dá)呈升高趨勢(shì)，而B(niǎo)cl-2呈下降趨勢(shì)。
　　3、選定干擾片段轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞，干擾TIEG1表達(dá)后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組、陰性組明顯下降。干擾TIEG1表達(dá)后，RT-PCR檢測(cè)Smad2、Smad3、Smad4、Smad7、Bax的表達(dá)較對(duì)照組、陰性組下降，而B(niǎo)cl-2表達(dá)升高。
　　4、動(dòng)物模型外周血

10、涂片顯示用藥組比對(duì)照組原始細(xì)胞減少。Western blot檢測(cè)顯示對(duì)動(dòng)物模型給予TIEG1后，Smad2、Smad3、Smad4、Smad7、Bax的表達(dá)較對(duì)照組升高，而B(niǎo)cl-2表達(dá)下降。RT-PCR檢測(cè)檢測(cè)顯示對(duì)動(dòng)物模型給藥后，Smad2、Smad3、Smad4、Smad7、Bax的表達(dá)較對(duì)照組升高，而B(niǎo)cl-2表達(dá)下降。
　　結(jié)論：
　　1、TIEG1對(duì)K562、 Raji、U937、HL-60白血病細(xì)胞具有增殖抑制