ST3GAL家族和ST6GALNAC家族在人慢性粒細胞白血病多藥耐藥中的作用.pdf

1、目的:
　　通過研究ST3GAL和ST6GALNAC家族在三對人慢性粒細胞白血病細胞株及慢性粒細胞白血病患者外周血單個核細胞中的差異表達，明確ST3GAL和 ST6GALNAC家族與人慢性粒細胞白血病多藥耐藥的相關性，并且研究miR-4701-5p以ST3GAL1作為靶點和miR-4299以ST6GALNAC4為靶點對人慢性粒細胞白血病多藥耐藥的影響，從而為預測和診斷慢性粒細胞白血病多藥耐藥性，尋求逆轉藥物提供新策略和靶點。

2、>　　方法:
　　(1)采用real-time PCR技術和western-blot技術檢測三對人慢性粒細胞白血病細胞株及慢性粒細胞白血病患者外周血單個核細胞中的ST3GAL和ST6GALNAC家族的表達情況，篩選出具有差異表達ST基因。
　　(2)特異性下調、上調差異表達的ST3GAL1基因和ST6GALNAC4基因，檢測干擾、過表達前后KCL22/ADR、KCL22細胞在體內、體外對化療藥物敏感性的變化。
　　(3

3、)采用real-time PCR檢測三對化學敏感和化學耐藥的人慢性粒細胞白血病細胞株和臨床慢性粒細胞白血病患者外周血單個核細胞中miR-4701-5p和miR-4299的表達變化。miR-4701-5p的模擬物(100nM)轉染到KCL22細胞中，將miR-4701-5p的拮抗劑轉染到KCL22/ADR細胞中，然后檢測ST3GAL1表達的變化。將miR-4299的模擬物(100nM)轉染到KCL22/ADR細胞中，將miR-4299的拮

4、抗劑轉染到KCL22細胞中，然后對ST6GALNAC4表達的變化進行檢測。將ST3GAL1和ST6GALNAC4的3'-UTR的靶基因序列(wt3'-UTR)和ST3GAL1和ST6GALNAC4的突變基因序列(mt3'-UTR)克隆到熒光素酶報告基因載體，然后將wt3'-UTR或mt3'-UTR載體和miR-4701-5p模擬物轉染到KCL22細胞中以及miR-4299模擬物轉染到KCL22/ADR細胞中，進行熒光素酶活性檢測。

5、>　　(4)將miR-4701-5p的模擬物轉染到KCL22細胞中，而miR-4701-5p的拮抗劑轉染到KCL22/ADR細胞中，將miR-4299的模擬物轉染到KCL22/ADR細胞中，而miR-4299的拮抗劑轉染到KCL22細胞中，檢測化學藥物阿霉素、紫杉醇和長春新堿的IC50值，用以研究miR-4701-5p和miR-4299是否可以在體外調節(jié)CML細胞的藥物敏感性。將轉染了miR-4701-5p的激活劑、miR-4701-5

6、p的拮抗劑、miR-4299的激活劑、miR-4299的拮抗劑和陰性對照的KCL22細胞和KCL22/ADR細胞接種到裸鼠體內，測量小鼠腫瘤體積;qRT-PCR和western blotting方法檢測腫瘤組織中ST3GAL1、ST6GALNAC4、miR-4701-5p和miR-4299的表達情況。
　　第一部分結果:
　　(1)ST3GAL2和ST3GAL3在KCL22、K562和KU812細胞中的表達與其阿霉素耐藥細胞

7、株的表達在統(tǒng)計學上無明顯差異;ST3GAL1和ST3GAL5在三種藥物敏感的親本細胞株中基因及蛋白的表達明顯增高（*P＜0.05）;ST3GAL4在三種耐藥細胞系中呈現(xiàn)高表達（*P＜0.05）;而ST3GAL6在三對慢性粒細胞白血病細胞株中無表達。
　　(2)ST3GAL4在CML/MDR患者外周血單個核細胞中呈高表達（*P＜0.05）;ST3GAL1和ST3GAL5在CML組中呈高表達（*P＜0.05）;ST3GAL2和ST3G

8、AL3的表達在兩組中無明顯差異;ST3GAL6在兩組中表達量較低。
　　(3)干擾ST3GAL1后的KCL22細胞株在mRNA和蛋白水平上的表達均顯著降低，作用于KCL22-ST3GAL1 shRNA1細胞的抗腫瘤藥物的IC50值明顯高于對照組。未經阿霉素治療的小鼠在第21天到第28天期間，可以觀察到注射KCL22-ST3GAL1 shRNA1的小鼠平均瘤體積(891±92 mm3)顯著高于shRNA對照組(585±62 mm3，

9、*P＜0.05)。在經阿霉素治療的小鼠中亦存在相同的現(xiàn)象。
　　(4)特異性上調ST3GAL1后，作用于KCL22/ADR/ST3GAL1細胞的抗腫瘤藥物的IC50值明顯低于KCL22/ADR/mock細胞的IC50值。小鼠在注射KCL22/ADR/ST3GAL1后的平均瘤體積明顯低于注射KCL22/ADR/mock的小鼠。給小鼠注射同樣的KCL22/ADR/ST3GAL1，經過阿霉素治療的小鼠平均瘤體積明顯小于未經過阿霉素治療的

10、小鼠。
　　(5)MiR-4701-5p的表達量在KCL22、K562和KU812細胞和慢性粒細胞白血病患者外周血單個核細胞中顯著下降，而ST3GAL1在化學敏感細胞株及藥物敏感患者的細胞中表達是升高的。轉染了模擬物的KCL22細胞中ST3GAL1的mRNA及蛋白的表達量明顯下降，在轉染了miR-4701-5p拮抗劑的KCL22/ADR細胞中，ST3GAL1的mRNA及蛋白的表達量明顯上升。轉染了wt3'-UTR載體的KCL22細

11、胞中miR-4701-5p表達的熒光素酶活性明顯下降，但是此結果可以被mtST3GAL1逆轉。
　　(6)MiR-4701-5p的高表達可顯著抑制KCL22細胞對化學藥物的敏感性，阿霉素、紫杉醇和長春新堿的IC50值升高。同時，在KCL22/ADR細胞中miR-4701-5p被拮抗劑所抑制后，可觀察到這三種化療藥物的IC50值下降。轉染了miR-4701-5p的小鼠的腫瘤體積在經過阿霉素化療后有明顯的改變，并且通過改變miR-47

12、01-5p的表達可以調節(jié)ST3GAL1 mRNA和蛋白的表達。
　　第二部分結果:
　　(1)ST6GALNAC1、ST6GALNAC2和ST6GALNAC6在KCL22、K562和KU812細胞中的表達與其阿霉素耐藥細胞株的表達在統(tǒng)計學上無明顯差異。ST6GALNAC4在三種耐藥細胞系中呈現(xiàn)高表達（*P＜0.05）;而ST6GALNAC3和ST6GALNAC5在三對慢性粒細胞白血病細胞株中無表達。
　　(2) ST6

13、GALNAC4在CML/MDR患者外周血單個核細胞中呈高表達（*P＜0.05）。ST6GALNAC1、ST6GALNAC2和ST6GALNAC6的表達在兩組中無明顯差異。ST6GALNAC3和ST6GALNAC5在兩組中表達量較少。
　　(3)干擾ST6GALNAC4后的KCL22/ADR細胞株在mRNA和蛋白水平上的表達均顯著降低，作用于KCL22/ADR-ST6GALNAC4 shRNA1細胞的抗腫瘤藥物的IC50值明顯低于對

14、照組。在經阿霉素治療的小鼠和未經阿霉素治療的小鼠中，注射KCL22/ADR-ST6GALNAC4 shRNA1的小鼠平均瘤體積均顯著低于shRNA對照組（*P＜0.05）。
　　(4)過表達ST6GALNAC4，作用于KCL22/ST6GALNAC4細胞的抗腫瘤藥物的IC50值明顯高于KCL22/mock細胞的IC50值。在經過阿霉素治療的小鼠和未經阿霉素治療的小鼠中，注射KCL22/ST6GALNAC4后的平均瘤體積均明顯高于K

15、CL22/mock組。
　　(5)在KCL22、K562和KU812細胞以及慢性粒細胞白血病患者外周血單個核細胞中miR-4299的表達量明顯上升，而ST6GALNAC4在化學敏感細胞株及藥物敏感患者的細胞中表達是下降的。在KCL22/ADR細胞中轉染了miR-4299模擬物后，ST6GALNAC4的mRNA及蛋白的表達量明顯的下降;在轉染了miR-4299拮抗劑的KCL22細胞中，則表現(xiàn)出相反的結果。而且，轉染了wt3'-UTR

16、載體的KCL22/ADR細胞中miR-4299表達的熒光素酶活性明顯下降，但是mtST6GALNAC4可以逆轉此結果。
　　(6)MiR-4299的高表達可上調KCL22/ADR細胞對化學藥物的敏感性，阿霉素、紫杉醇和長春新堿的IC50值下降;同時，在KCL22細胞中miR-4299被拮抗劑所抑制后，可觀察到這三種化療藥物的IC50值上升。轉染了miR-4299的小鼠的腫瘤體積在經過阿霉素化療后有明顯的改變，并且改變miR-442

17、99的表達可以調節(jié)ST6GALNAC4 mRNA和蛋白的表達。
　　結論:
　　(1)ST3GAL家族和ST6GALNAC家族在三對人慢性粒細胞白血病親本細胞株及其三對化學耐藥細胞株中存在差異表達。
　　(2)ST3GAL家族和ST6GALNAC家族在耐藥與非耐藥的慢性粒細胞白血病患者外周血單個核細胞中存在差異表達。
　　(3)改變ST3GAL1和ST6GALNAC4的表達，可以調控KCL22和KCL22/ADR