高產(chǎn)β-甘露聚糖酶菌株選育、構(gòu)建及其酶學(xué)特性研究.pdf

1、向油井注入壓裂液是油田增產(chǎn)的重要措施之一，為提高壓裂效果，壓裂液中常加入增稠劑（如瓜爾膠、魔芋膠等）。高黏度的壓裂液在完成壓裂后需要迅速破膠，在壓裂液中加入生物酶破膠劑可以使增稠劑降解，以達(dá)到破膠的目的。本研究將篩選到的降解瓜爾膠高產(chǎn)β-甘露聚糖酶的菌株Chryseobacterium sp.HL-28，及東北林業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保存的降解魔芋膠的菌株Bacillus subtilis WD23、B.subtilis K依次進(jìn)行紫外誘變

2、、甲基磺酸乙酯誘變和60Co誘變，再將獲得的遺傳穩(wěn)定性好的誘變菌株Man基因進(jìn)行克隆，并利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了β-甘露聚糖酶的異源表達(dá)，并對(duì)重組酶的酶學(xué)特性進(jìn)行了研究。獲得的主要結(jié)果如下:
　　(1)降解瓜爾膠菌株的篩選和鑒定
　　從亞麻漚麻液中篩選到一株降解瓜爾膠產(chǎn)β-甘露聚糖酶的菌株，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性和16s rDNA序列分析，鑒定該菌株為黃桿菌科（Flavobacteriaceae）金黃桿菌屬（Chry

3、seobacterium）細(xì)菌，定名為Chryseobacterium sp.HL-28。
　　(2)瓜爾膠和魔芋膠降解菌的誘變育種
　　Chryseobacterium sp.HL-28、B.subtilis WD23和B.subtilis K在培養(yǎng)13h時(shí)菌體數(shù)量達(dá)到最大值，確定紫外誘變時(shí)菌體培養(yǎng)時(shí)間為13h。Chryseobacterium sp.HL-28發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)23h時(shí)，酶活性達(dá)到最大，B.subtilis W

4、D23和B.subtilis K發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)11h時(shí)，酶活性達(dá)到最大。
　　以Chryseobacterium sp.HL-28、B.subtilis WD23和B.subtilis K為出發(fā)菌株，紫外線誘變篩選出3個(gè)突變株:Chryseobacterium sp.H30、B.subtilis W12和B.subtilisK116，酶活力比出發(fā)菌株分別提高了426.53％、8.72％和13.97％。以B.subtilis W12和

5、B.subtilis K116為出發(fā)菌株，利用甲基磺酸乙酯進(jìn)行化學(xué)誘變，篩選出2個(gè)突變株:B.subtilis WL-12和B.subtilis KL-116，酶活力比出發(fā)菌株分別提高了1.29％和3.97％。以B.subtilis WL-12和B.subtilis KL-116為出發(fā)菌株，經(jīng)過60Co射線誘變，篩選出2個(gè)突變菌株:B.subtilis WLY-12和B.subtilis KLY-116，酶活力比出發(fā)菌株分別提高了16.

6、89％和7.72％，酶活力分別達(dá)到4181.82U/mL和4095.48U/mL。比最原始的出發(fā)菌株B.subtilis WD23和B.subtilisK提高了28.72％和27.65％。誘變研究結(jié)果表明，物理誘變效果好于化學(xué)誘變。
　　(3)B.subtilis WLY-12 Man基因的克隆與表達(dá)
　　根據(jù)GenBank上公布的Man基因序列，采用primer premier5.0設(shè)計(jì)引物，梯度PCR擴(kuò)增Man基因序列，

7、經(jīng)測(cè)序該基因有1089bp，該序列在GenBank注冊(cè)登錄號(hào)為KC979152。Man基因與表達(dá)載體pPIC9K用T4DNA連接酶連接，獲得重組表達(dá)載體pPIC9K/Man。將重組表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化到酵母菌GS115中，通過直接PCR鑒定表明得到了pPIC9K/Man/GS115陽性菌株。經(jīng)過甲醇誘導(dǎo)72h后，丙酮沉淀蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)到重組蛋白，分子量約為41kDa。用魔芋膠作底物，DNS方法測(cè)定重組β-甘露聚糖酶的活性達(dá)5

8、156.742U/mL，比B.subtilis WLY-12的β-甘露聚糖酶活性提高了23.31％。
　　(4)重組β-甘露聚糖酶分離純化及其酶學(xué)特性研究
　　發(fā)酵培養(yǎng)pPIC9K/Man/GS115酵母菌，上清液即為粗酶液。粗酶液經(jīng)85％飽和度的硫酸銨鹽析、透析脫鹽、PEG20000濃縮、DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析和Sephadex G-75凝膠過濾層析后獲得純化的重組蛋白15 mL，總

9、酶活54183.9 U，總蛋白3.75mg，甘露聚糖酶比活力14449.04 U/mg，收率10.51％，純化倍數(shù)9.70，純化效率較高。重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)到單一蛋白條帶，得到電泳純的蛋白質(zhì)。飛行質(zhì)譜拼接的肽段與NCBI中已經(jīng)公布的甘露聚糖酶同源性高達(dá)99％，表明分離純化步驟合理，結(jié)果可靠。
　　研究發(fā)現(xiàn)重組甘露聚糖酶發(fā)揮催化作用的最適pH為6.3，最適溫度是65℃。Al3+、Hg+、Fe2+和Fe3+對(duì)重組酶有強(qiáng)