甘草甜素對幼鼠顳葉癲癇海馬神經(jīng)元的保護作用及其機制研究.pdf

1、背景和目的：
　　癲癇是兒童時期常見的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，70-80％的癲癇患者通過抗癲癇藥物的治療能控制癲癇的發(fā)作，但仍有20-30%左右的癲癇患者在接受規(guī)范合理的抗癲癇藥物治療后依然有發(fā)作而成為難治性癲癇。顳葉癲癇在難治癲癇中最常見，一直以來都是癲癇治療的難點。大量研究表明，顳葉癲癇的反復發(fā)作可致海馬區(qū)神經(jīng)元的丟失及海馬硬化，這不僅對病人的生活、工作產(chǎn)生巨大的影響，也給患者的家庭和社會造成了很大的負擔。目前的抗癲癇藥物主要作用于

2、離子通道，抑制神經(jīng)元的興奮性，進行對癥治療。深入研究癲癇的病因和發(fā)病機制，針對發(fā)作機制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)發(fā)現(xiàn)新藥物、尋求新的治療途徑，是癲癇治療未來發(fā)展的方向。
　　近年來越來越多的研究表明:癲癇與炎癥密切相關(guān)，高遷移率族蛋白1（High mobility group protein1，HMGB1）是一種重要的細胞炎癥因子，正常情況下主要存在于細胞核中，參與維持核小體的結(jié)構(gòu)和基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，當發(fā)生組織損傷時迅速從損傷的神經(jīng)元、小膠質(zhì)細胞

3、和星形膠質(zhì)釋放到細胞外、腦脊液及血清中，它的釋放是觸發(fā)免疫反應的危險信號，在膿毒癥、關(guān)節(jié)炎等多疾病中具有重要的作用，最新研究發(fā)現(xiàn)其與癲癇的發(fā)生也有著緊密的聯(lián)系。Toll樣受體4（Toll-like receptor4，TLR4）是一種識別病原相關(guān)分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）的受體，能識別損傷或應激所致的“內(nèi)源性危險信號”如：HMGB1，激活核轉(zhuǎn)錄因子kappa B（

4、Nuclear factor-k-gene binding，NF-κB）發(fā)生磷酸化，磷酸化的NF-κB（Phosphorylated Nuclear factor-k-gene binding，p-NF-κB）進入細胞核，誘導促炎因子基因表達，腦內(nèi)炎癥導致癲癇反復發(fā)作。而甘草類藥物有較好的抗炎、抗過敏和細胞膜保護作用，并且有較高的安全性和耐受性，臨床上已廣泛用來治療肝炎、皮膚病等，最近國內(nèi)外有研究表明甘草甜素（Glycyrrhizin，

5、GL）作為HMGB1的小分子抑制劑，在炎癥抑制方面有一定作用，并且有較好的安全性和耐受性，且部分藥物可穿過血腦屏障，有望成為抗癲癇藥物的候選者，但關(guān)于甘草類藥物的神經(jīng)元保護及抗癲癇作用的機制，目前還缺乏臨床及實驗數(shù)據(jù)的支持。
　　本研究在用海人酸（Kainic acid，KA）誘導建立幼鼠顳葉癲癇模型的基礎(chǔ)上，采用甘草甜素（Glycyrrhizin，GL）預處理，通過觀察行為學表現(xiàn)，探討甘草甜素對海人酸誘導幼鼠癲癇發(fā)作的敏感性及嚴

6、重性的影響，利用Western blot與Q-RT-PCR分別從蛋白質(zhì)與mRNA水平檢測海馬組織HMGB1/TLR4/p-NF-κB的表達，運用HE染色及免疫組化從細胞凋亡水平觀察海馬區(qū)神經(jīng)元的丟失情況，探討甘草甜素可能的抗癲癇及神經(jīng)保護機制，及其與腦內(nèi)免疫炎性反應的關(guān)系，有望老藥新用，找到癲癇治療的新方向并為其提供理論依據(jù)。
　　材料與方法：
　　出生21天的SD大鼠，隨機分為對照組、模型Ⅰ組、模型Ⅱ組。模型Ⅰ組用KA誘導

7、癲癇發(fā)作，模型Ⅱ組在應用KA前30min腹腔注射GL，模型Ⅰ組根據(jù)觀察時間點不同分為3h、12h、24h、7d四個亞組，模型Ⅱ組根據(jù)GL不同劑量分為10mg/kg、50mg/kg、100mg/kg三個亞組，每個亞組3只動物，行為學表現(xiàn)按照Racine評分量表進行評分，RT-PCR檢測急性期（3h、12h、24h）海馬區(qū)HMGB1/TLR-4 mRNA的表達，Western blot檢測HMGB1/TLR-4/p-NF-κB蛋白的表達，E

8、lisa檢測血清中HMGB1蛋白的表達變化，免疫組化檢測慢性期（7d）海馬神經(jīng)元抗核抗體（Neu-N）的表達。
　　結(jié)果：
　　1.行為學結(jié)果：模型Ⅰ組SE發(fā)生率為75%，死亡4只，存活率為：67.3%， SOT:24.08±1.98min；模型Ⅱ組SE發(fā)生率為64.3%，總共死亡6只，存活率85.7%，SOT:33.39±2.66min；生理鹽水對照組大鼠均未死亡，存活率為100%；GL預處理模型Ⅱ組與模型Ⅰ組比較，SE發(fā)

9、生率降低，存活率增高，SOT時間延長。
　　2.癲癇急性期海馬區(qū) HMGB1/TLR-4基因表達結(jié)果：模型Ⅰ組與對照組比較，隨著觀察時間（3h、12h、24h）的延長，HMGB1、TLR-4基因表達升高,其中12h時達到峰值（差異具有統(tǒng)計學意義，P＜0.05），12h時間點，其中模型Ⅱ組HMGB1、TLR-4基因表達量較模型Ⅰ組顯著降低（差異具有統(tǒng)計學意義，P＜0.05）,不同劑量的干預的模型Ⅱ組之間無顯著差異（P＞0.05）。<

10、br>　　3.癲癇急性期海馬區(qū)HMGB1/TLR-4/p-NF-κB蛋白表達結(jié)果：模型Ⅰ組與對照組比較，隨著觀察時間（3h、12h、24h）的延長，TLR-4、p-NF-kB蛋白表達升高,其中12h時達到峰值（差異具有統(tǒng)計學意義，P＜0.05），HMGB1的蛋白表達沒有明顯變化（P＞0.05）。在12小時的時間點，模型Ⅱ組TLR-4、p-NF-kB蛋白表達量較模型Ⅰ組顯著降低（差異具有統(tǒng)計學意義，P＜0.05），不同劑量的干預的模型Ⅱ組

11、之間差異不大（P＞0.05）。
　　4.癲癇急性期血清中HMGB1表達結(jié)果：模型Ⅰ組與對照組比較，血清中HMGB1濃度增高，其中12h時明顯（差異具有統(tǒng)計學意義，P＜0.05），在12h的時間點，模型Ⅱ組與模型Ⅰ組比較，血清中 HMGB1的濃度顯著降低（差異具有統(tǒng)計學意義，P＜0.05），不同劑量的干預的模型Ⅱ組之間差異不大（P＞0.05）。
　　5.慢性期海馬區(qū)Neu-N表達結(jié)果：模型Ⅰ組與對照組比較，海馬區(qū)神經(jīng)元顯著丟失

12、（差異具有統(tǒng)計學意義，P＜0.05），模型Ⅱ組與模型Ⅰ組比較,海馬區(qū)神經(jīng)元的丟失顯著減少（差異具有統(tǒng)計學意義，P＜0.05），不同劑量的干預的模型Ⅱ組之間差異不大（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.GL預處理可以延長幼鼠癲癇發(fā)作的潛伏期，降低癲癇發(fā)作的易感性，減輕幼鼠癲癇的發(fā)作。
　　2.幼鼠癲癇急性期海馬HMGB1/TLR-4基因表達增加，TLR-4的蛋白表達增高，誘導NF-κB的磷酸化。
　　3.GL預處