Shh信號通路對髁突肥大軟骨細(xì)胞凋亡活性影響的研究.pdf

1、髁突肥大(Condylar hyperplasia，CH)是發(fā)生于青少年的一種具有自限性的單側(cè)髁突過度生長性疾病，無性別差異，常導(dǎo)致患者面部偏斜和咬合紊亂，從而影響美觀和咀嚼。髁突肥大的確切發(fā)病機(jī)制未明，關(guān)于其治療方式目前仍以髁突高位切除術(shù)為主。因此，針對髁突肥大病因開展基礎(chǔ)研究，有助于探索新的治療方式，從而在疾病的早期阻斷其發(fā)生，減輕或避免手術(shù)帶來的創(chuàng)傷。
　　大量臨床證據(jù)和組織學(xué)證據(jù)已證實(shí)患側(cè)髁突的生長活躍是髁突肥大的主要病因

2、。髁突軟骨是髁突的生長中心，其生長過程包括軟骨細(xì)胞的增殖、分化、肥大及凋亡等重要過程。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，與正常髁突軟骨細(xì)胞相比，髁突肥大軟骨細(xì)胞的增殖能力顯著升高。但是關(guān)于髁突肥大軟骨細(xì)胞的凋亡活性變化對髁突肥大病理進(jìn)程的影響目前尚未見相關(guān)報道。
　　經(jīng)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，在正常軟骨的生長發(fā)育過程中，Shh信號通路發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。Shh信號通路的主要成分包括配體Shh，膜受體Ptc和Smo以及轉(zhuǎn)錄因子Gli等。Tavella

3、S等研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)的Shh信號通路能夠抑制小鼠肢體關(guān)節(jié)軟骨的凋亡。而且Shh信號能夠通過介導(dǎo)PI3K/AKT或ERK進(jìn)而來調(diào)控細(xì)胞的凋亡。但是Shh信號通路對髁突肥大軟骨細(xì)胞凋亡活性的影響尚未明晰，因此，本研究擬探究Shh信號通路在髁突肥大軟骨中的表達(dá)情況，并驗(yàn)證Shh信號通路對髁突肥大軟骨細(xì)胞凋亡活性的影響以及潛在的分子機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)一、軟骨組織標(biāo)本的收集和軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)
　　方法：
　　1，標(biāo)本來源：正常髁

4、突軟骨標(biāo)本來至于第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院髁突骨折手術(shù)患者（骨折塊無法固定），髁突肥大軟骨標(biāo)本源于武漢大學(xué)口腔醫(yī)院SPECT陽性的髁突肥大手術(shù)患者；
　　2，組織標(biāo)本的處理：選取結(jié)構(gòu)完整的正常髁突軟骨標(biāo)本及髁突肥大軟骨標(biāo)本各3例，常規(guī)多聚甲醛固定，EDTA脫鈣；
　　3，軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)：利用酶消化法分離培養(yǎng)軟骨細(xì)胞；收集第二代軟骨細(xì)胞，轉(zhuǎn)藻酸鹽微珠三維培養(yǎng)，以防止軟骨細(xì)胞的去分化。
　　結(jié)果：在平板培養(yǎng)狀態(tài)下，軟骨細(xì)胞形

5、態(tài)多為多角形、三角形，少數(shù)呈圓形或短梭形，細(xì)胞集聚生長成簇，呈“鋪路石”樣外觀。藻酸鹽三維培養(yǎng)狀態(tài)下微珠呈水滴狀或圓形，軟骨細(xì)胞呈圓球形亮點(diǎn)狀散在分布。
　　結(jié)論：利用機(jī)械和酶聯(lián)合消化法能夠獲得細(xì)胞活性較高的髁突軟骨細(xì)胞。
　　實(shí)驗(yàn)二、Shh信號通路在髁突肥大軟骨細(xì)胞的表達(dá)變化情況
　　方法：
　　1，選取正常髁突軟骨及髁突肥大軟骨組織標(biāo)本各3例，利用免疫組化染色檢測Shh及其膜受體Smo在兩組軟骨中的表達(dá)情況；

6、
　　2，在三維培養(yǎng)的第21天分別收集正常軟骨細(xì)胞及髁突肥大軟骨細(xì)胞，提取總蛋白及RNA，然后利用Western blotting及Real-time PCR分別從蛋白及基因水平檢測Shh及Smo在兩組軟骨細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：免疫組化染色結(jié)果顯示，髁突肥大軟骨中Shh和Smo均呈異常高表達(dá)，且主要集中于未分化間充質(zhì)層和肥大層。與正常髁突軟骨細(xì)胞相比，髁突肥大軟骨細(xì)胞中Shh和Smo蛋白和基因的表達(dá)水平均顯著增高（P

7、＜0.05）。
　　結(jié)論：Shh信號通路在髁突肥大軟骨中呈異常高表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)三、Shh信號通路對髁突肥大軟骨細(xì)胞凋亡活性的影響
　　方法：將軟骨細(xì)胞隨機(jī)分為三組：正常髁突軟骨細(xì)胞組（NC組）、髁突肥大軟骨細(xì)胞組（CH組）及Cyclopamine（Smo受體阻斷劑）刺激肥大軟骨細(xì)胞組（CH+Cyclo組），在三維培養(yǎng)的第5、12、19天分別向CH+Cyclo組添加Cyclopamine刺激48h，分別提取總蛋白及RN

8、A，然后利用Western blotting和Real-time PCR檢測Cleaved-caspase3在三組細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：與NC組相比，CH組中Cleaved-caspase3基因及蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05），添加Cyclopamine阻斷Shh信號通路之后，Cleaved-caspase3基因及蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）。
　　結(jié)論：Shh信號通路能夠抑制髁突肥大軟骨細(xì)胞的

9、凋亡。
　　實(shí)驗(yàn)四、Shh信號通路對軟骨細(xì)胞凋亡活性影響的機(jī)制研究
　　方法：將軟骨細(xì)胞隨機(jī)分為4組：CH組、CH+Cyclo組、LY294002刺激髁突肥大軟骨細(xì)胞組（CH+LY294002組）及U0126刺激髁突肥大軟骨細(xì)胞組（CH+U0126組）。在三維培養(yǎng)的第5、12、19天分別用Cyclopamine、LY294002（PI3K/AKT阻斷劑）及U0126（MAPK/ERK阻斷劑）刺激細(xì)胞48h，于第21天分別提取

10、總蛋白和RNA，然后利用Western blotting檢測Cleaved-caspase3、AKT、ERK、P-AKT及P-ERK的表達(dá)變化情況，并用Real-time PCR檢測Cleaved-caspase3 mRNA的表達(dá)情況。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：與CH組相比，CH+Cyclo組中AKT及ERK均無明顯變化（P＞0.05），但其磷酸化狀態(tài)P-AKT及P-ERK的表達(dá)卻顯著降低（P＜0.05）。與CH組相比，CH+LY29400