線粒體ND基因單核苷酸多態(tài)性與肝細胞肝癌發(fā)病風險的相關性研究.pdf

1、目的：
　　肝細胞肝癌（HCC）是最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率居全球惡性腫瘤的第三位。在中國，肝細胞肝癌的發(fā)病率正在上升，目前占世界肝細胞肝癌總數的55％，這給人民身體素質的提升及國民經濟的發(fā)展造成了嚴重的威脅。近年來很多研究發(fā)現線粒體DNA(mitochondrial DNA)突變和單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphis ms)與腫瘤的發(fā)生相關。不同于核DNA（nuclear DNA），線粒

2、體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）由于缺乏組蛋白保護、它的修復能力差以及處于富含活性氧（ROS）環(huán)境中，所以容易產生氧化應激損傷，因而容易發(fā)生基因改變。在我們實驗團隊前期的研究中，我們已經發(fā)現線粒體D-loop區(qū)基因的多態(tài)性和肝細胞肝癌的發(fā)病風險存在相關性。線粒體基因的D-loop區(qū)通過影響線粒體基因轉錄和復制從而改變線粒體基因，然而線粒體編碼區(qū)的基因幾乎不含內含子，所以線粒體編碼區(qū)基因單核苷酸多態(tài)性可以通過改變

3、編碼的氨基酸類型改變氧化磷酸化的功能從而影響線粒體功能。線粒體編碼區(qū)基因與肝細胞肝癌的相關性很少有人研究，所以開展線粒體編碼區(qū)基因與肝細胞肝癌的相關性研究具有重要的意義。本研究通過對ND基因進行擴增測序，并與標準序列進行比對從而找出多態(tài)性基因位點，利用病例-對照統(tǒng)計學方法分析多態(tài)性基因位點與HCC發(fā)病風險的相關性，這為HCC易患人群早期篩查及防治工作提供新思路。
　　方法：
　　1.研究對象及標本采集：病例組的80例肝細胞肝

4、癌患者為2007年9月至2008年3月期間在河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院肝膽外科住院病人，這些病人術前經免疫學檢查和影像學方法臨床診斷為肝細胞肝癌，并且這些病人術后病理證實為肝細胞肝癌。對照組是2008年10月至2009年4月期間河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院采集的正常人抗凝靜脈血標本。
　　2.基因組DNA提?。悍蛛x提取肝細胞肝癌組病人血樣及對照組血樣基因組DNA，提取基因組DNA后將其置于4℃的恒溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>　　3.PCR擴增ND

5、基因：從NCBI數據庫中查找ND基因，ND基因包含七個基因片段，即ND1、ND2、ND3、 ND4L、ND4、ND5和ND6，將ND基因按大約600bps的長度劃分為13段小的基因片段，根據引物設計原則為每段小基因片段設計PCR上游及下游引物，然后用PCR預混試劑盒進行基因擴增，擴增的產物經過瓊脂糖凝膠電泳后，再放入凝膠成像系統(tǒng)中（美國Image公司）證實擴增出DNA條帶，最后把擴增的產物送至生工生物工程技術有限公司（Shanghai）

6、進行測序。
　　3.統(tǒng)計學分析：采用t檢驗比較計量資料，采用χ2檢驗或Fisher確切概率法比較計數資料，并計算P值。所有實驗數據均使用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，P＜0.05時被認為有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1.肝細胞肝癌組和對照組臨床資料對比：兩組間性別、年齡無明顯差異(P>0.05)。
　　2.從肝細胞肝癌組中隨機的選出30例標本DNA進行擴增測序，分析后發(fā)現4820G/A(P=0.237)

7、,4824A/G(P=0.112),5301A/G(P=0.237)的SNP分布頻率與對照組相比在肝細胞肝癌發(fā)病風險中具有潛在意義。
　　3.對4820G/A,4824A/G,5301A/G所屬基因片段的病例數量進行擴大（80例），發(fā)現5301A/G位點的SNP在病例組與對照組間的分布頻率存在統(tǒng)計學差異（χ2=4.783，P=0.029）。ND2基因的5301A/G位點SNP可導致ND2編碼蛋白的第278位氨基酸ILE（異亮氨酸）

8、轉換為LEU（亮氨酸），這可能影響ND2編碼蛋白的功能進而影響整個呼吸鏈的功能，最終增加肝細胞肝癌的發(fā)病風險。
　　4.將5301A/G位點SNP分布與肝細胞肝癌患者的臨床特征進行比較分析，結果顯示，5301A/G位點SNP和肝細胞肝癌患者的臨床特征，包括年齡、性別、腫瘤數目、腫瘤長徑、Child分級、臨床分期及門脈瘤栓等都無相關性（P＞0.05）。
　　結論:
　　1.mtDNA編碼區(qū)ND基因上的5301A/G位點S