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文檔簡介
1、目的:慢性阻塞性肺疾病(COPD)是常見的呼吸系統(tǒng)慢性病,具有高患病率及高死亡率等特點(diǎn),其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,可能與多個基因變異相關(guān),動物模型的建立與研究對了解其發(fā)病機(jī)制尤為重要。本研究旨在探索并構(gòu)建新的小鼠COPD模型,并從小鼠一般狀況、肺組織病理變化等多個方面對其進(jìn)行評估。對上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)標(biāo)志物(E-cadherin、α-SMA及collagenⅠ)在COPD模型組及對照組中表達(dá)情況進(jìn)行觀察,并進(jìn)行半定量PCR,初步篩選出
2、與COPD相關(guān)的候選基因。在小鼠COPD模型、香煙煙霧提取物(CSE)刺激的人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE)及相應(yīng)對照組中通過定量PCR、Dot bolt、Western blot及免疫熒光等檢查,研究該候選基因在其中的表達(dá)情況;對myh14在COPD的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮的作用進(jìn)行探討,為將來進(jìn)一步研究其在COPD中的具體作用機(jī)制打下基礎(chǔ)。
方法:⑴通過采用CSE聯(lián)合脂多糖(LPS)滴鼻建立小鼠COPD模型,將20只雄性C57/
3、BL6小鼠隨機(jī)平均分為正常對照組及COPD模型組,于建模第42天同時處死小鼠,每組隨機(jī)選取6只小鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。⑵觀察對照組及模型組的一般情況、肺組織病理變化(HE染色、PAS染色)、肺平均內(nèi)襯間隔(MLI)及肺泡破壞指數(shù)(DI),免疫組化觀察EMT表現(xiàn)。⑶對支氣管肺泡灌洗液(BALF)進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)觀察。⑷用兩組小鼠肺組織作為標(biāo)本進(jìn)行半定量PCR初步篩選出與COPD相關(guān)的候選基因。⑸用定量PCR、Dot blot檢測篩選出的候選基因
4、(myh14)在小鼠肺組織中mRNA及蛋白表達(dá)水平。⑹MTT法選擇細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中最適CSE刺激濃度,按CSE對細(xì)胞刺激的不同時間進(jìn)行分組,用定量PCR及Dot blot檢測myh14在各組細(xì)胞中mRNA及蛋白表達(dá)水平,并通過免疫熒光法觀察各組細(xì)胞中myh14的分布與表達(dá)。⑺Western blot檢測CollagenⅠ及α-SMA在COPD模型組及對照組肺組織中的蛋白表達(dá)水平。8、COPD模型組進(jìn)行myh14與E-cadherin、α-SM
5、A、CollagenⅠ之間相關(guān)性分析。
結(jié)果:①一般情況:觀察兩組小鼠毛發(fā),活動等情況,COPD模型組小鼠較對照組出現(xiàn)活動減少,消瘦,呼吸困難等表現(xiàn),對照組小鼠存活率100%;模型組存活率為80%。②肺組織病理學(xué)及形態(tài)結(jié)構(gòu)變化:對照組氣道及肺泡結(jié)構(gòu)完整、清晰,較少炎性細(xì)胞浸潤,肺泡間隔無明顯增厚及斷裂出現(xiàn)。模型組氣道上皮結(jié)構(gòu)紊亂,出現(xiàn)黏液高分泌,肺泡壁斷裂并融合成肺大泡,有較多炎性細(xì)胞浸潤。模型組MLI及DI均較對照組升高(P
6、<0.05)。③BALF細(xì)胞分類計(jì)數(shù):COPD模型組BALF中細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞比例均較對照組升高(P<0.05)。④免疫組化及相關(guān)性分析:對照組氣道上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,胞漿內(nèi)可見大量myh14陽性表達(dá),而模型組myh14表達(dá)減少(P<0.05);模型組E-cadherin較對照組減少(P<0.05);模型組氣道平滑肌增生較對照組明顯;模型組氣道壁膠原沉積明顯,CollagenⅠ表達(dá)較對照組增多(P<0.05)。模型組氣道上皮myh14
7、、E-cadherin平均光密度值(IOD/area)較對照組減少(P<0.05),模型組CollagenⅠ平均光密度值(IOD/area)較對照組升高(P<0.05)。平均光密度值相關(guān)性分析顯示模型組myh14與E-cadherin呈正相關(guān)(r=0.967,P<0.01),與CollagenⅠ呈負(fù)相關(guān)(r=-0.925,P<0.01)。⑤半定量PCR篩選COPD相關(guān)候選基因結(jié)果:經(jīng)過對兩組小鼠肺組織進(jìn)行半定量PCR COPD相關(guān)候選基
8、因篩選,發(fā)現(xiàn)Slc9a2、Foxj1及Gif在兩組中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),Chrm1、Sprr2b、Rag1、Dusp5、Cldn2、Cldn22、Scin差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),Morc3、Rela、Akt1、Pik3r1、IL6ra、Myh14、Tpm3、Crabp2、Sprr2a2、Lyn、Srrm4、C/EBP、Gabarap、Elk1、Hk2、Tjap1、Strada兩組間有明顯差異(P<0.01),選取
9、差異明顯的myh14作為COPD相關(guān)基因進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。⑥CSE細(xì)胞毒性試驗(yàn):對不同CSE濃度刺激24h的16HBE細(xì)胞進(jìn)行MTT法檢測各組細(xì)胞活性,在CSE濃度≤2.5%時,細(xì)胞活性降低不明顯,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),當(dāng)CSE濃度大于2.5%時,細(xì)胞活性出現(xiàn)明顯下降(P<0.01)。故選用2.5%CSE進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。⑦實(shí)時熒光定量PCR: myh14在小鼠COPD模型組中相對mRNA含量(RQ值)較對照組下降(P<0.05
10、),CSE對16HBE細(xì)胞不同時間刺激(8h、24h)組中myh14mRNA水平均較對照組下降(P<0.01),CSE8h及24h刺激組間存在差異,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。8、Dot blot、Westem blot結(jié)果及相關(guān)性分析:Dot blot結(jié)果顯示,COPD模型組myh14蛋白表達(dá)水平較對照組下降(P<0.05),Western blot結(jié)果顯示模型組中α-SMA及collagenⅠ蛋白表達(dá)水平均較對照組升高(P<
11、0.05);相關(guān)性分析顯示模型組中蛋白表達(dá)水平上myh14與α-SMA呈負(fù)相關(guān)(r=-0.833,P<0.05),與collagen呈負(fù)相關(guān)(r=-0.953,P<0.01)。16HBE細(xì)胞經(jīng)CSE刺激(8h、24h)后,Dot blot顯示myh14在蛋白表達(dá)水平上均較對照組明顯下降(P<0.01),CSE8h及24h刺激組間存在差異性,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。9、16HBE細(xì)胞中myh14免疫熒光檢測:綠色熒光為myh1
12、4在細(xì)胞中的陽性表達(dá),myh14表達(dá)于細(xì)胞胞漿內(nèi),CSE刺激組(8h,24h)較對照組熒光表達(dá)明顯減弱(P<0.01),不同CSE刺激組間存在差異,且差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
結(jié)論:⑴CSE聯(lián)合LPS滴鼻可成功構(gòu)建小鼠COPD模型。⑵COPD中存在EMT現(xiàn)象的發(fā)生。⑶myh14可在人支氣管上皮細(xì)胞及小鼠支氣管上皮細(xì)胞表達(dá),且在小鼠COPD模型及經(jīng)CSE刺激的16HBE細(xì)胞中存在mRNA及蛋白水平下降。⑷myh14可
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