抗HER2人源化單克隆抗體在乳酸克魯維酵母中的表達及其產物分析.pdf

1、HER2/neu基因是一種原癌基因，位于人染色體17q21，其編碼產物p185erbB2蛋白具有酪氨酸激酶活性，為表皮生長因子受體家族成員之一。當HER2/neu基因過度表達時，存在于多種腫瘤組織，包括乳腺癌、卵巢癌、結腸癌、肺癌、胃癌、前列腺癌和宮頸癌等均可檢測到該基因?？笻ER2人源化單克隆抗體直接作用于p185erbB2胞外域，因而是一種理想的靶向治療藥物。體內外實驗均證明：抗HER2人源化單克隆抗體能抑制過度表達HER2/neu

2、基因的乳腺癌細胞生長。 目前，抗體主要采用哺乳動物表達系統(tǒng)生產，但哺乳動物表達系統(tǒng)生產成本高，使每個療程的抗體藥物費用高達數萬美元，難以實現(xiàn)抗體藥物的廣泛應用。乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis，K．．lactis)作為一種較完善的外源基因表達系統(tǒng)，不僅具有易于高密度發(fā)酵、外源基因穩(wěn)定整合在宿主基因組中，可對外源蛋白進行糖基化修飾等酵母共有的優(yōu)點外，還具有遺傳背景清楚和表達系統(tǒng)安全等優(yōu)點。K．．lactis

3、表達系統(tǒng)已成功表達多種外源蛋白，但尚未見用于全抗體表達的研究報道，因此，本研究擬利用K．．lactis表達系統(tǒng)，以抗HER2單克隆抗體為模型，研究K．．lactis表達系統(tǒng)表達全抗體的能力，并對表達產物進行結構和生物學活性的分析，為開發(fā)抗體藥物生產新平臺奠定基礎。 本研究主要結果如下： 1.構建了抗HER2人源化單克隆抗體輕、重鏈表達載體，實現(xiàn)了全抗體在K．．lactis中的表達。對用于K．．lactis中的信號肽和

4、啟動子進行初步分析，結果表明：誘導型啟動子LAC4與MFα信號肽的組合能夠獲得較高的抗體表達水平，搖瓶表達水平可達120±20mg．L-1。 2.表達產物利用HiTraprProteinAFF親和柱純化，純化產物經SDS-PAGE、Westernblot分析以及與PNGaseF酶切分析，結果顯示：K．．lactis表達的抗HER2人源化單克隆抗體的輕、重鏈能夠協(xié)調表達，并且能夠自發(fā)通過分子間二硫鍵正確裝配成完整的抗體分子，且抗