抗人CD13單克隆抗體的研制.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模和ㄟ^基因免疫的方法研制抗人髓細(xì)胞表面分子CD13單克隆抗體。 實(shí)驗(yàn)方法：1)RT-PCR克隆人CD13分子酶活性域(第69～480位氨基酸)基因，將此基因插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/CD13。2)用基因免疫的方法，將重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/CD13通過肌肉注射免疫BALB/C小鼠，經(jīng)兩次常規(guī)免疫后，經(jīng)尾靜脈注射高表達(dá)CD13的髓細(xì)胞白血病細(xì)胞系HL60進(jìn)行

2、加強(qiáng)免疫。3)用常規(guī)免疫學(xué)技術(shù)，取基因免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞系NS1融合，初步篩選出穩(wěn)定大量分泌抗人CD13單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。4)使用各種高表達(dá)或不表達(dá)CD13的細(xì)胞系、正常人外周血細(xì)胞和10例白血病患者骨髓樣本，通過間接免疫熒光流式細(xì)胞術(shù)、熒光顯微鏡檢測(cè)以及WesternBlot實(shí)驗(yàn)，對(duì)單抗進(jìn)一步的鑒定，獲得特異性和臨床符合率最好的雜交瘤細(xì)胞株2E3。5)經(jīng)免疫球蛋白類別檢測(cè)試劑盒檢測(cè)抗人CD13單抗類別。6)對(duì)2E3進(jìn)

3、行小鼠體內(nèi)擴(kuò)大培養(yǎng)，將誘生腹水通過羥基磷灰石柱親和層析制備純品2E3，并用FITC標(biāo)記，制備抗人CD13單抗FITC-2E3。7)通過競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)，明確2E3與已知常用抗人CD13單抗所識(shí)別CD13分子表位的異同。 結(jié)果：1)構(gòu)建了重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/CD13，經(jīng)測(cè)序鑒定完全正確。2)共獲得7株大量穩(wěn)定分泌抗人CD13單克隆抗體的的雜交瘤克隆株。3)抗人CD13單抗類別均為IgM類，κ鏈。4)獲得抗人CD13

4、單抗純品2E3及熒光標(biāo)記抗體FITC-2E3，經(jīng)鑒定可用于FCM(流式細(xì)胞術(shù))，適用于臨床白血病MFC-IM診斷。5)2E3與已知抗CD13單抗Leu-M7、WM15識(shí)別CD13分子不同表位。 結(jié)論：用基因免疫的方法，成功研制出抗人CD13單克隆抗體，并獲得純品2E3和熒光標(biāo)記單抗FITC-2E3，不僅可用于MFC-IM檢測(cè)，并可以進(jìn)一步對(duì)其相關(guān)生物學(xué)功能進(jìn)行研究，使之可能用于科研或臨床治療。同時(shí)，結(jié)果表明，對(duì)于一些表達(dá)在細(xì)胞表