兩株新型抗人CD133單克隆抗體的研制及其生物學特性的研究.pdf

1、自從1997年Yin等報道了CD133分子（當時命名為AC133抗原，現(xiàn)又稱人類Prominin-1）以來，該分子已成為干細胞研究的熱點。CD133分子已成為分離、鑒定包括造血系統(tǒng)和中樞神經系統(tǒng)等不同組織來源干細胞的新的表面標記之一。人CD133基因編碼由865個氨基酸組成的五跨膜（5TM）糖蛋白，總分子量為120KDa。CD133分子的轉錄由5個不同的啟動子控制，導致至少有12個CD133異構體剪接形成，每個異構體以組織特異性方式表達

2、，并受甲基化狀態(tài)調控。CD133基因的不同剪接本產生不同的CD133異構體已經逐步得以鑒定。CD133在分子量和蛋白結構上與已知的4TM和7TM受體家族成員不同，提示CD133是5TM受體超家族中的一個新成員。同時CD133的分子結構和蛋白表達提示它可能作為一種生長因子受體而起作用，并參與細胞間信號傳遞。 CD133 mRNA在成人多個系統(tǒng)組織中表達，CD133蛋白表達在正常的造血干祖細胞和胚胎神經上皮細胞，以及一些腫瘤細胞。體

3、外實驗顯示，CD133+腫瘤細胞具有自我更新、增殖和多系分化等腫瘤干細胞（CSC）特征，越來越多的證據(jù)表明，CD133分子是人類腫瘤干細胞（CSC）標志物之一，這提示CD133+腫瘤細胞代表了獨特的CSC群體，CD133分子可能成為新的腫瘤治療的靶點。但是CD133分子是否參與腫瘤干細胞的失控性增殖和自我更新尚待進一步研究。CD133相對應的配體分子及其細胞內與之相互作用的下游通路分子目前均不明確，而且對CD133分子的研究缺乏有效的實

4、驗手段。鑒此，研制抗人CD133功能性單克隆抗體將拓展對CD133分子的研究，也為腫瘤干細胞研究和生物治療提供新的途徑。 本研究首先克隆了人CD133基因，和構建了穩(wěn)定表達CD133的轉基因細胞，繼而成功地研制了兩株鼠抗人CD133單克隆抗體，并對其生物學特性進行了初步分析。在此基礎上，探討了CD133分子在腫瘤細胞的表達及其對人單核細胞白血病細胞株SHI-1的生物學效應。 一、人CD133基因的克隆、基因轉染細胞株的構

5、建以及抗人CD133單克隆抗體的研制。 目的：克隆人CD133編碼區(qū)全長基因，構建能穩(wěn)定表達人CD133分子的基因轉染細胞株，進而以此為免疫原研制抗人CD133單克隆抗體。 方法：以AC133-2抗原的基因序列為模板，通過重疊延伸PCR法克隆人CD133編碼區(qū)全長基因，并進行測序驗證；獲得的CD133編碼區(qū)全長基因經Hind-Ⅲ和BamH-Ⅰ雙酶切后插入真核表達載體pIRES2-EGFP中，構建成重組pIRES2-EGF

6、P/CD133。采用脂質體法將重組pIRES2-EGFP/ CD133質粒轉染L929細胞，用G418抗生素篩選獲得穩(wěn)定表達CD133的基因轉染細胞；流式細胞術分析報告基因GFP的表達及CD133分子在基因轉染細胞膜上的表達。以表達人CD133分子的基因轉染細胞L929/ CD133為免疫原，常規(guī)免疫BALB/c小鼠，采用B淋巴細胞雜交瘤技術進行細胞融合，并以表達CD133分子的視網膜母細胞瘤細胞株WERI-RB-Ⅰ和L929/mock

7、分別流式篩選陽性、陰性雜交瘤克隆，經間接免疫熒光標記和流式細胞術分析、反復篩選和多次克隆化培養(yǎng)，獲得2個特異性分泌鼠抗人CD133分子單克隆抗體的雜交瘤細胞株；采用細胞核染色體計數(shù)、Ig亞型快速定性試紙法、競爭結合抑制等實驗，對獲得的雜交瘤細胞株及單克隆抗體進行初步的生物學特性的鑒定。 結果： （1）成功地克隆了人CD133編碼區(qū)全長基因，針對CD133編碼區(qū)全長基因構建的重組質粒經雙酶切后，能夠釋放出2600bp左右的

8、目的基因片段，DNA測序進一步證明插入載體中的基因片段與CD133基因的序列完全一致。 （2）獲得G418抗生素耐藥的CD133基因轉染細胞，流式細胞儀檢測表明，GFP報告基因在基因轉染細胞L929/CD133高表達，同時CD133基因轉染的L929細胞膜上能穩(wěn)定表達人CD133蛋白。 （3）成功獲得2株持續(xù)和穩(wěn)定分泌鼠抗人CD133單克隆抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為14D7和10G11。雜交瘤細胞核型分析顯示，雜交瘤

9、細胞株的染色體數(shù)目在100條以上，超過小鼠B細胞和SP2/0細胞的染色體數(shù)，表明為融合體；經過快速定性試紙分析顯示，2株單抗輕鏈均為κ鏈，14D7重鏈為IgG2a亞類，而10G11重鏈為IgG2b亞類；單抗識別的抗原表位分析結果表明，單抗10G11對商品化的抗CD133單抗AC141與CD133的結合產生部分競爭抑制作用；而14D7對AC141與CD133的結合無競爭作用，14D7和10G11之間沒有競爭作用，由此表明，研制的2株抗人C

10、D133單抗14D7和10G11與商品化抗CD133單抗AC141識別的位點不完全相同。 結論：成功構建了穩(wěn)定高表達人CD133分子的基因轉染細胞，為研制抗人CD133單克隆抗體提供了有效的免疫原。成功獲得2株穩(wěn)定分泌特異性鼠抗人CD133單抗的雜交瘤細胞株，這2株單抗與商品化抗人CD133單抗識別CD133抗原的不完全相同位點。 二、鼠抗人CD133單克隆抗體的生物學特性及其對人單核細胞白血病細胞系SHI-1的體外生物

11、學效應。 目的：分析人CD133分子在腫瘤細胞上的表達，并對其生物學特性進行初步分析，觀察單抗對表達CD133的人單核細胞白血病細胞系SHI-1的體外生物學作用，為抗CD133單抗用于腫瘤干細胞研究提供實驗依據(jù)。 方法：采用間接免疫熒光法分析單抗對不同來源人腫瘤細胞株、人胚前腦永生化神經前體細胞（hSN12W-TERT）以及正常入骨髓細胞和外周血單個核細胞的識別作用；免疫組織化學方法分析兒童髓母細胞瘤、胎盤組織CD133

12、分子的表達。研究CD133單克隆抗體14D7對SHI-1的體外生物學效應，包括：細胞形態(tài)的動態(tài)觀察、活細胞計數(shù)和MTT法分析SHI-1的增殖；PI染色和流式細胞儀分析SHI-1細胞的周期分布；Annexin V/PI染色和流式細胞儀檢測細胞凋亡；進一步流式細胞儀分析單抗刺激前后SHI-1細胞CD95/CD95L、CD14以及PD-L1、PD-1、B7-H3等分子表達的改變。 結果： （1）2株單抗的免疫熒光標記和流式分析

13、顯示，白血病來源的細胞株U937、SHI-1、腸上皮來源的Caco-2、視網膜母細胞瘤WERI-RB-Ⅰ和Y79表達人CD133分子，正常入骨髓細胞有CD133的低表達；人胚前腦永生化神經前體細胞（hSN12W-TERT）高表達人CD133分子。 （2）2株抗體的免疫組織化學染色法也顯示，成人胎盤和兒童髓母細胞瘤表達CD133。 （3）單抗14D7加入SHI-1細胞體外培養(yǎng)后形態(tài)觀察顯示，細胞數(shù)量逐步減少，細胞呈不規(guī)則型

14、，胞體固縮，出現(xiàn)較多細胞碎片；活細胞計數(shù)法和MTT法結果表明，單抗14D7能明顯抑制SHI-1細胞增殖，并呈劑量和時間依賴性效應；Annexin V/PI染色顯示，單抗14D7作用后，細胞呈現(xiàn)凋亡和細胞周期的G1/S期阻滯；免疫熒兆標記和流式細胞術分析顯示，單抗14D7作用后12h，SHI-1細胞表面CD95和CD95L分子均上調表達，免疫協(xié)同抑制分子PD-L1、PD-1、B7-H3表達下調，而分化抗原CD14亦呈一過性表達下調（刺激后

15、18-24h最顯著）。 結論：使用本實驗研制的2株單克隆抗體免疫熒光標記和流式細胞分析顯示，CD133分子在一些腫瘤細胞株表達。免疫組化分析表明CD133分子表達在成人胎盤和兒童髓母細胞瘤，由此提示所獲得的2株特異性單抗不僅可以作流式分析，而且還可以用于免疫組化分析。單抗14D7通過作用于SHI-1細胞表達的CD133分子，誘導SHI-1細胞周期的G1/S期阻滯，抑制SHI-1細胞增殖，通過活化CD95/CD95L途徑促發(fā)凋亡性

16、細胞死亡，同時還下調協(xié)同抑制分子PD-L1、PD-1和B7-H3的表達，由此表明：本實驗所研制的特異性抗人CD133單抗14D7是一株CD133的功能性抗體，將為研究CD133的生物學功能和腫瘤干細胞提供新的手段。 小結： （1）克隆獲得人CD133編碼區(qū)的全長基因，構建了基因轉染細胞株L929/CD133。 （2）以L929/CD133為免疫原免疫小鼠研制獲得2株特異性鼠抗人CD133單克隆抗體14D7和10G