鋅指基因ZNF580過表達對內皮細胞基因表達譜的影響.pdf

1、目的:研究人C2H2型鋅指轉錄因子新基因ZNF580過表達對內皮細胞基因表達譜的影響,為闡明ZNF580基因的功能提供新的實驗依據。
　　 方法:
　　 1人臍靜脈內皮細胞株EA.hy926,用含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基在37℃、5％CO2、飽和濕度下培養(yǎng),至EA.hy926細胞生長成單層后備用。
　　 2采用脂質體法將真核表達載體pEGFP-ZNF580和pEGFP-C1導入EA.hy926內皮細胞,

2、用含400μg/mlG418的完全培養(yǎng)基篩選并建立穩(wěn)定的轉染細胞株EA.hy926pEGFP-ZNF580和EA.hy926pEGFP-C1,擴大培養(yǎng)后用RT-PCR和Western Blot方法鑒定ZNF580基因的表達。
　　 3利用MTT比色法分析ZNF580對內皮細胞增殖活性的影響。
　　 4應用基因芯片分析EA.hy926pEGFP-ZNF580和EA.hy926pEGFP-C1細胞株的基因表達譜,并通過Rea

3、l Time-PCR方法驗證19個差異基因。
　　 5生物信息學分析芯片結果,MEME算法對差異基因啟動子區(qū)域中的一致性序列進行計算;差異基因構建信號通路圖。
　　 結果:
　　 1在熒光顯微鏡下可見,EA.hy926pEGFP-C1細胞,綠色熒光蛋白布滿內皮細胞整個胞漿,而EA.hy926pEGFP-ZNF580細胞,融合有綠色熒光蛋白的ZNF580蛋白聚集于內皮細胞核中。經RT-PCR和Western Blo

4、t方法鑒定,通過轉染內皮細胞,篩選獲得穩(wěn)定細胞株EA.hy926pEGFP-ZNF58和EA.hy926pEGFP-C1。
　　 2基因芯片篩選差異表達基因發(fā)現(xiàn)上調的基因有78個包括轉化生長因子β1(TGFβ1)、轉化生長因子β2(TGFβ2)、成纖維生長因子1(FGF1)、成纖維生長因子(FGF2)、白介素8(IL8)、鋅指基因480(ZNF480),下調的基因有66個,包括集落刺激因子2(CSF2)、乙酰輔酶A乙酰轉移酶2(

5、ACAT2)、SMAD1、基質金屬蛋白酶10(MMP10)、ATP結合盒8(ABCA8)、Krüppel因子9(KLF9)、磷酸二酯酶3A(PDE3A)等。差異表達基因的功能涉及內皮細胞許多方面,包括細胞周期調控基因,信號轉導相關基因,與血管生成和重塑相關基因,轉錄活性調控基因及翻譯活性調控基因等。
　　 3 EA.hy926pEGFP-ZNF580細胞增殖活性顯著高于EA.hy926 pEGFP-C1細胞。
　　 4

6、MEME法預測出ZNF580所結合的九個堿基的一致性序列為CCAG[G/C]CTGG,該序列的E-value值最小,為1.1e-531。生物信息學分析,ZNF580在EA.hy926細胞株中,參與細胞周期和血管生成的調節(jié)方面,發(fā)揮了重要作用。
　　 結論:
　　 1成功建立ZNF580基因穩(wěn)定轉染細胞株EA.hy926 pEGFP-ZNF580和對照株EA.hy926pEGFP-C1。
　　 2應用基因芯片技術分

7、析EA.hy926pEGFP-ZNF580和EA.hy926pEGFP-C1細胞株的差異表達基因,從芯片結果挑選10個上調表達和9個下調表達基因用Real Time-PCR方法進行驗證,結果提示基因芯片結果假陽性率低,可信度高。
　　 3 ZNF580基因轉染內皮細胞EA.hy926后引起EA.hy926細胞基因表達譜廣泛改變。
　　 4 ZNF580可以促進內皮細胞EA.hy926增殖。
　　 5對差異基因的分