ZNF580在ROS介導的內皮細胞炎癥反應中的作用研究.pdf

1、ZNF580是由本課題組克隆的一種新的鋅指蛋白基因,該基因定位于人19號染色體19q13.42,最初是以LDL誘導人臍靜脈內皮細胞系ECV304,篩選人主動脈cDNA文庫得到的新基因(Genbank注冊號:AF184939),國際人類基因命名委員會命名為ZNF580。ZNF580與Krüppel樣鋅指轉錄因子(Krüppel-like factors,Klfs)家族成員類似,其功能仍在進一步研究中,本實驗旨在探討ZNF580在ROS介導

2、的內皮細胞炎癥反應中的信號轉導機制。
　　 目的:
　　 以人臍靜脈內皮細胞株(EA.hy926)為體外模型,在典型的活性氧(reactive oxygen species,ROS)-H2O2的作用下,研究人C2H2型鋅脂蛋白新基因ZNF580表達情況,分析ZNF580基因表達與氧化應激相關的核轉錄因子NF-κB轉錄激活之間的關系,以及ZNF580基因過表達對炎癥因子IL-8的釋放和單核細胞遷移趨化的影響,進一步揭示ZN

3、F580在ROS介導的內皮細胞炎癥反應中的作用。
　　 方法:
　　 1人臍靜脈內皮細胞株(EA.hy926),用含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基在37℃、5％CO2、飽和濕度下培養(yǎng)。
　　 2 H2O2是一個細胞損傷的刺激因素,而LDH(乳酸脫氫酶)是反映細胞膜完整性的重要檢測指標。為確定H2O2對內皮細胞的損傷情況,不同濃度H2O2(0-600μM)作用于EA.hy926細胞6h后,提取細胞上清,采用LD

4、H活性檢測分析H2O2對內皮細胞的損傷作用。
　　 3胰酶消化收集對數(shù)生長期EA.hy926細胞,將其懸浮于高糖DMEM細胞培養(yǎng)液中,濃度約為5-6×106/ml,接種到六孔板中2 ml/孔,37℃,5％CO2孵箱培養(yǎng)。在各孔內加H2O20μM、50μM、100μM、200μM、300μM、400μM,每組設三個平行孔。1h后收集細胞,提取總RNA和蛋白,利用半定量RT-PCR、Western blot方法檢測不同濃度H2O2對

5、ZNF580表達的影響。
　　 4在各孔中加入濃度為100μ的H2O2,每組設三個平行孔,于0h、0.5h、1h、2h、4h、6h后收集細胞,提取總RNA和蛋白,同樣利用半定量RT-PCR、Wegern blot方法檢測不同作用時間的H2O2對ZNF580表達的影響。
　　 5內皮細胞經不同處理后,實驗分為對照組、H2O2處理組、PDTC干預組和DMSO對照組。各組細胞爬片后固定,免疫細胞化學檢測H2O2和特異性抑制劑P

6、DTC對NF-κB亞基p65激活表達的影響。
　　 6同樣EA.hy926細胞分為不同的處理方式,抽提RNA以及蛋白,利用半定量RT-PCR擴增和Western blot方法檢測H2O2是否通過NF-κB信號通路影響和調節(jié)ZNF580的表達。
　　 7利用pEGFP-ZNF580和pEGFP-C1瞬時轉染EA.hy926內皮細胞,獲得瞬時過表達ZNF580的EA.hy926細胞。運用倒置熒光顯微鏡觀察轉染效率,RT-PC

7、R以及western-blot技術鑒定轉染后ZNF580的表達情況。
　　 8運用real-time PCR技術從轉錄水平檢測構建的瞬時高表達ZNF580內皮細胞和正常內皮細胞中白介素-8的表達差異。以ELISA方法從蛋白表達水平檢測構建的瞬時高表達ZNF580內皮細胞和正常內皮細胞中白介素-8的表達差異。
　　 9人急性單核細胞白血病細胞株(THP-1),用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃、5％CO2

8、、飽和濕度下培養(yǎng)。遷移趨化實驗分析瞬時高表達ZNF580內皮細胞和正常內皮細胞中IL-8對單核細胞株THP-1遷移率的影響。
　　 結果:
　　 1不同濃度H2O2作用于EA.hy926細胞,LDH測定結果顯示,H2O2濃度為400μM時,LDH的釋放量最大。
　　 2不同濃度H2O2作用EA.hy926內皮細胞1h后,提取RNA擴增ZNF580片段,以及western-blot觀察ZNF580的蛋白表達水平,結

9、果證實,ZNF580在mRNA轉錄水平和蛋白水平的表達均有增加,并呈現(xiàn)濃度依賴的趨勢。(P＜0.05)。在濃度為100μM時,ZNF580的表達最高。
　　 3濃度為100μ的H2O2作用EA.hy926內皮細胞不同時間后,由RT-PCR和western-blot檢測可知ZNF580 mRNA和蛋白水平的表達增加(P＜0.05)。在刺激時間為1h時,ZNF580的表達最高。
　　 4 H2O2作用可激活NF-κB亞基p6

10、5由細胞質轉移至細胞核,而特異性抑制劑PDTC存在時,可抑制NF-κB亞基p65在EA.hy926細胞內的核轉位。陰性對照DMSO未引起p65核轉位。對照組可見棕色顆粒位于細胞質中,細胞核中未見。
　　 5 NF-κB信號通路抑制劑PDTC和H202共同處理可抑制ZNF580 mRNA及蛋白的上調表達,而單獨H202的處理可明顯上調ZNF580 rnRNA及蛋白的表達。6脂質體瞬時轉染ZNF580質粒于EA.hy926細胞中,成

11、功構建瞬時高表達ZNF580的EA.hy926細熒光顯微鏡鑒定轉染效率為50％左右,RT-PCR和western-blot鑒定結果顯示:與轉染pEGFP-C1的細胞相比,轉染pEGFP-ZNF580的細胞ZNF580表達量顯著升高(P＜0.01)。
　　 7 Real-time PCR及ELISA分析結果表明,高表達ZNF580的EA.hy926細胞中IL-8的mRNA轉錄和蛋白表達顯著增高。高表達ZNF580的EA.hy926

12、細胞表達的IL-8顯著高于正常細胞(P＜0.01)。
　　 8 Transwell實驗檢測分析結果表明,高表達ZNF580的EA.hy926細胞對單核細胞THP-1遷移趨化作用有明顯的促進作用,與正常組比較結果有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 結論:
　　 H2O2通過NF-κB信號通路影響ZNF580的表達,進一步促進其下游的炎癥因子IL-8的釋放,ZNF580在內皮細胞炎癥反應中起著重要的作用。該研究闡明