新型豬胰島素樣生長因子-1的基因克隆及表達分析.pdf

1、為構建高效促動物生長基因，探索研制新型促動物生長制劑。本實驗室應用重疊區(qū)基因拼接法(Gene Splice by Overlap Extension，GSOE)對胰島素樣生長因子-1基因加以改造。在其N端引入BamHI的酶切位點，C端引入BglⅡ和EcoRI酶切位點以及終止密碼子，并在酶切位點之前添加保護性堿基。去除了N端四個末端氨基酸(Gly-Pro-Glu-Thr) 以及中間 C區(qū)Gly-Set-Ser-Ser-Arg-Arg-Al

2、a部分序列，保留其活性部位?？寺CR產物于pMD18一T載體上測序，測序結果顯示，PCR產物大小為205bp，編碼59個氨基酸，與目的片段大小一致。將測序正確的PCR產物構建了pGEX-4T-1-IGF-1D原核表達載體。經BamHI和EcoRI酶切及質粒PCR鑒定，證實本實驗構建的新型胰島素樣生長因子基因-1已克隆到原核表達載體pGEX-4T-1上，為進一步研究其誘導表達條件及生物學功能奠定了基礎。 將已構建的pGEX-4

3、T-1-IGF-1D蛋白表達載體質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)，用2×YTA培養(yǎng)基培養(yǎng)，以IPTG誘導融合蛋白表達，作SDS-PAGE分析表達情況。結果顯示，表達蛋白分子量約為33kDa，與預期目標帶大小一致。將誘導條件經過溫度梯度、時間梯度以及IPTG濃度梯度的分析選擇進行優(yōu)化。通過優(yōu)化原核誘導表達條件，發(fā)現(xiàn)pGEX-4T-1-IGF-1D蛋白在37℃，IPTG終濃度為0.5mM的條件下誘導4小時，蛋白表達效果較佳。 將