中國(guó)青島文昌魚TNF1和TNFR1的克隆及功能初步研究.pdf

1、文昌魚在進(jìn)化上特殊的地位，為揭示免疫系統(tǒng)的起源和進(jìn)化以及低等生物的免疫系統(tǒng)的研究提供了一個(gè)很好的模型?，F(xiàn)在對(duì)脊椎動(dòng)物的TNFSF和TNFRSF的起源和進(jìn)化并不是很清楚。本文通過一系列研究方法對(duì)中國(guó)青島文昌魚的一個(gè)TNF和一個(gè)TNFR分子進(jìn)行了研究。為這兩個(gè)家族成員及它們信號(hào)通路的起源和進(jìn)化提供了線索。 本文首次在文昌魚中克隆了一個(gè)TNFSF成員——TNF1和一個(gè)TNFRSF成員一-TNFR1。搜索佛羅里達(dá)文昌魚基因組獲得了一條編

2、碼含有TNF domain分子的序列，據(jù)此設(shè)計(jì)特異引物通過PCR獲得了青島文昌魚的TNF1的序列；同時(shí)在全魚和消化道cDNA文庫(kù)中，獲得了TNFR1的完整的序列。兩者都是跨膜分子，都具有其家族成員的典型特征：TNF1在其C端具有一個(gè)TNF domain；而TNFR1在其N端具有4個(gè)CRD，在胞內(nèi)具有一個(gè)TRAF結(jié)合位點(diǎn)。Southern blot的結(jié)果表明文昌魚的TNF1具有兩個(gè)拷貝，而TNFR1則只有一個(gè)拷貝。通過real time

3、PCR和原位雜交方法證明兩個(gè)基因都在文昌魚主要的免疫器官——消化道中有高表達(dá)；在受LPS刺激時(shí)，在感染的早期就會(huì)有比較高的上調(diào)(分別在刺激6小時(shí)和4小時(shí)后)。這表明在進(jìn)化過程中，TNFSF-TNFRSF系統(tǒng)在文昌魚這個(gè)時(shí)期已經(jīng)參與免疫反應(yīng)。在文昌魚的胚胎發(fā)育階段，兩個(gè)基因都具有比較相似的表達(dá)模式：在胚胎發(fā)育早期(囊胚期和原腸胚)和幼蟲階段有比較高的表達(dá)。 成功地用pET28a 構(gòu)建了文昌魚TNF1的原核表達(dá)載體：pET28a-T

4、NF1，并用表達(dá)宿主菌B121對(duì)文昌魚TNF1進(jìn)行了比較成功的重組表達(dá)。經(jīng)過Ni柱親和層析和陰離子交換層析等方法，獲得較純的可溶的目的蛋白。純化的蛋白注射文昌魚后，并沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖、遷移或者組織病變等現(xiàn)象。 構(gòu)建了文昌魚TNF1和TNFR1的真核表達(dá)載體，成功的轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞并且在其中表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明文昌魚的TNF1是跨膜分子。CoIP實(shí)驗(yàn)表明，文昌魚的TNF1可以和TNFR1相互作用。由于TNFR1的胞內(nèi)區(qū)具有一個(gè)TR