文昌魚TLR與TNF信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的功能和進(jìn)化研究.pdf

1、隨著比較免疫學(xué)的迅速發(fā)展，以及美國文昌魚全基因組測序的完成，又由于TLR與TNF系統(tǒng)在進(jìn)化過程中表現(xiàn)出眾多的物種特異性。文昌魚作為由無脊椎動(dòng)物到脊椎動(dòng)物進(jìn)化的代表，成為解釋這兩個(gè)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)演化的關(guān)鍵所在。因此，本論文以文昌魚的TLR與TNF信號(hào)通路為研究對(duì)象，通過比較基因組，各種免疫生物學(xué)檢測手段得到以下幾方面的研究結(jié)果： 1.文昌魚中存在一個(gè)全新的TLR系統(tǒng)，包括數(shù)十個(gè)TLR受體和數(shù)十個(gè)的TIR接頭分子。本論文選取其中最具代表

2、性的BbtTLR1與BbtMyD88進(jìn)行功能研究，研究表明BbtTLR1是由文昌魚特有的反轉(zhuǎn)錄插入事件插入到PSMB7/10的內(nèi)含子中產(chǎn)生的，是文昌魚TLR家族的一個(gè)典型代表。該基因?qū)?xì)菌感染，尤其是革蘭氏陰性菌的感染有明顯作用。我們還發(fā)現(xiàn)BbtTLR1能夠增強(qiáng)BbtMyD88對(duì)NF-κ與AP-1的激活作用，這表明了V-type TLR-MyD88-NF-κB/AP-1信號(hào)通路在文昌魚中已經(jīng)建立，這是首次在脊椎動(dòng)物以外報(bào)道該信號(hào)通路的存

3、在。除此之外，我們還證明了無論是BbtTLR1還是BbtMyD88都不能激活I(lǐng)FN-β信號(hào)通路，再加上文昌魚不具備TLR7/8/9，IRF3/7等的直系同源基因，我們推測TLR-MyD88-IFN-β信號(hào)通路是在無脊椎動(dòng)物向脊椎動(dòng)物分化后才出現(xiàn)。 2.文昌魚擁有發(fā)達(dá)且特異的TNF信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，包括24個(gè)TNF配體，36個(gè)TNF受體，24個(gè)TRAF接頭分子，以及數(shù)百個(gè)含有死亡結(jié)構(gòu)域的接頭分子?；蚪M縱向比較表明文昌魚10個(gè)TRAIL

4、-like基因是通過隨機(jī)復(fù)制所得，并且該信號(hào)通路的雛形首次在文昌魚中形成。我們從青島文昌魚中克隆得到五個(gè)TRAIL-like分子，盡管它們具有高度的序列同源性(50-80％不等)，但卻分布在文昌魚不同組織中，在抗感染過程中也扮演著不同的角色。除了配體的多樣性之外，我們還發(fā)現(xiàn)TRAIL的受體在文昌魚中不僅以多基因的形式存在，還存在多剪接體的方式。我們推測TRAIL信號(hào)通路在文昌魚抗感染過程和凋亡過程中發(fā)揮重要的作用，并且它自身同時(shí)存在著一

5、個(gè)完善的自我調(diào)控機(jī)制。 　　3.我們從青島文昌魚中克隆得到一個(gè)獨(dú)立進(jìn)化的死亡受體BbtDR1，序列分析表明它是由FADD的死亡結(jié)構(gòu)域與TNF受體的CRD結(jié)構(gòu)域重組而來，并且在文昌魚中以單拷貝的形式存在。由于序列保守性差，單獨(dú)在293T細(xì)胞中表達(dá)BbtDR1并不能誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，雖然它能正常的表達(dá)在細(xì)胞膜表面。我們進(jìn)一步從文昌魚中克隆得到兩個(gè)FADD分子，命名為BbtFADD1和BbtFADD2。Southern雜交印證FADD分子在

6、文昌魚基因組中的復(fù)雜性。初步研究BbtFADD1能通過其死亡結(jié)構(gòu)域與BbtDR1的死亡結(jié)構(gòu)域相互作用，而BbtFADD2則不能。這表明基因組隨機(jī)復(fù)制產(chǎn)生的某些死亡結(jié)構(gòu)域蛋白，在文昌魚中并未獲得確切的功能，而獲得功能者將隨著進(jìn)化歷程被固定下來。同時(shí)，這種相互作用也表明死亡受體通過FADD誘導(dǎo)凋亡的信號(hào)通路在文昌魚中已經(jīng)建立，這是首次在無脊椎動(dòng)物中確立該信號(hào)通路，對(duì)闡明TNF誘導(dǎo)凋亡的信號(hào)通路進(jìn)化過程有著承上啟下的作用。 4.除了

7、受體的多樣性之外，文昌魚還存在一個(gè)龐大的TRAF家族，包括1個(gè)TRAF4，1個(gè)TRAF6，4個(gè)TRAF3以及十幾個(gè)TRAF1/2分子。研究表明BbtTRAF6在自身三聚化的情況下，通過其Ring finger和Zinc finger結(jié)構(gòu)域激活NF-κB與JNK信號(hào)通路，并且這種激活作用能夠被BbtTRAF4所抑制。TRAF4單獨(dú)可以微弱的激活NF-κB，卻不能激活JNK信號(hào)通路。BbtTRAF2a，BbtTRAF3a不能激活任一個(gè)信號(hào)通

8、路，但BbtTRAF3a能夠與BbtTNFR1的胞內(nèi)區(qū)相互作用。除此之外，本論文還在文昌魚中確立了TNFR1-TRAF6-NF-κB信號(hào)通路?；趯?duì)文昌魚TRAF家族功能的分析，我們進(jìn)行了橫縱向比較，得出TRAF家族的復(fù)制，功能的擴(kuò)增以及雙接頭分子的出現(xiàn)，對(duì)脊椎動(dòng)物TLR與TNF信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的協(xié)同進(jìn)化有著至關(guān)重要的作用的，這是首次貫穿整個(gè)生物進(jìn)化歷程對(duì)TRAF家族的全面分析，也是首次提出了TNF與TLR信號(hào)網(wǎng)絡(luò)協(xié)同進(jìn)化的概念。 5

9、.從青島文昌魚中克隆得到BbtMyD88-NF-κB和BbtTRAF6-NF-κB信號(hào)通路中另外兩個(gè)關(guān)鍵分子：BbtlκB與BbtκB-ras。序列分析表明BbtlκB在基因組上是以單拷貝的形式存在，是IκB家族的一個(gè)新成員，該基因在文昌魚神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和幼蟲時(shí)期直到成體階段的免疫防御過程有重要的作用。并且在293T細(xì)胞中能夠抑制NF-κB的活性，是文昌魚BbtMyD88，BbtTRAF6信號(hào)通路中下游的一個(gè)關(guān)鍵基因。BbtκB-ras

10、是一個(gè)典型的GTPases分子，在文昌魚基因組中以雙拷貝的形式存在，這兩個(gè)拷貝在無脊椎動(dòng)物與脊椎動(dòng)物分化后，成為脊椎動(dòng)物κB-rasl與κB-ras2。表達(dá)譜分析表明，在LPS刺激下，文昌魚κB-ras與BbtIκB有相似的表達(dá)譜，暗示了它們之間相互作用后成為文昌魚NF-κB信號(hào)通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子。本論文首次對(duì)文昌魚TLR與TNF進(jìn)行系統(tǒng)的功能分析，表明盡管文昌魚缺乏典型的脊椎動(dòng)物適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，它依然具有有效且特異的防御機(jī)制。同時(shí)，本論