五味子木脂素對環(huán)孢素A藥動學及腎毒性的影響研究.pdf

1、目的:
　　環(huán)孢素A(CyclosporineA，CsA)作為一種強效的免疫抑制劑，被普遍的應用于器官移植和自身免疫性疾病的治療。盡管其有強效的治療作用，但其引發(fā)的副作用，如急性、慢性腎臟損傷、嚴重的高血壓和神經(jīng)毒性，很大程度上限制了它在臨床上的長期使用。五味子木脂素源于中國傳統(tǒng)中藥五味子（Schisandra chinensis）成熟果實，長期應用于中醫(yī)的臨床應用治療中，具有多種藥理活性，如抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗菌以及保肝、護

2、心、益腎等作用，主要應用于治療肝炎、腎臟功能不全、神經(jīng)衰弱等疾病。在中國，應用以CsA為基礎免疫抑制劑治療時，用藥方案往往聯(lián)合五味子及其制劑以防治CsA引發(fā)的腎臟毒性，但二藥聯(lián)合應用的機制尚不完全清楚。因此，本文旨在以臨床上常用的免疫抑制劑CsA及五味子提取物和五味子乙素為主要研究對象，采用LC/MS/MS技術研究五味子提取物單次給藥對CsA藥動學影響，并在此基礎上，深入探討五味子木脂素聯(lián)合CsA合并用藥后防治CsA腎臟毒性的潛在機制，

3、為科學闡釋五味子防治CsA腎臟毒性的科學內涵提供實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1.建立測定CsA在生物樣品中LC/MS/MS分析方法
　　采用Hypersil BDS C18柱(2.1×50mm，3.5μm，Waters, USA)為固定相，流動相為甲醇和含10mM乙酸銨水溶液(80∶20);流速為0.2mL/min，樣品進樣量為10μL，柱溫為60℃，以FK520為內標物，用電噴霧離子源(ESI)，正離子模式進行多反應

4、模式檢測，并對方法學的專屬性、精密度、準確度、基質效應、提取回收率、線性范圍、穩(wěn)定性進行考察。
　　2.五味子提取物(SCE)單次給藥對CsA藥動學影響研究
　　雄性SD大鼠，隨機分組后分別灌服蒸餾水、不同劑量的五味子提取物溶液(54、108、216mg/kg)，約10min后在灌胃給予CsA（25mg/kg）后，于給藥后5、15、30、45(min)、1、2、3、4、6、8、12、24、36、48(h)從大鼠眼眶后靜脈血管

5、叢取血約0.4mL，置于肝素化的1.5mL離心管中，對血樣除蛋白，濃縮樣品，復溶，LC/MS/MS分析。求得藥-時曲線并用DAS2.1藥動學軟件處理藥動學參數(shù)。
　　3.五味子提取物(SCE)對CsA致腎毒性保護作用的體內研究
　　采用低鈉飲食，口服灌胃CsA復制出大鼠CsA腎毒性。五味子、CsA及二者聯(lián)合給藥SD大鼠，觀察五味子對CsA腎毒性大鼠的一般情況的影響。連續(xù)給藥28天后，收集血清、腎臟等組織。評價各組藥物處理對大

6、鼠腎損傷情況:測定血清肌酐(sCr)、尿素氮(BUN)水平;五味子提取物對CsA致大鼠腎毒性氧化應激相關指標如丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)分析測定;腎臟組織切片進行H&E染色和Masson's染色，進行腎臟病理結構分析，考察五味子對CsA腎毒性炎癥細胞浸潤和慢性腎小管間質纖維化的影響。Western blotting檢測4-HNE、HO-1、Nrf2、P-gp、Cleaved caspase

7、3、Bax、LC3A/B檢測腎組織蛋白表達，研究五味子在CsA腎毒性中的保護作用。
　　4.五味子乙素(SchB)對CsA致HK-2細胞氧化應激、凋亡和自噬的影響作用研究
　　常規(guī)培養(yǎng)HK-2細胞，MTT法分別檢測CsA、SchB及二者聯(lián)用對HK-2細胞存活率的影響;SchB預處理HK-2細胞，考察二藥聯(lián)用對HK-2細胞LDH、GSH、ROS、MMP變化的影響;AnnexinⅤ-FITC/PI雙染流式細胞儀檢測對細胞凋亡的影

8、響;Cyto-ID(@)綠色熒光染料流式細胞儀和激光共聚焦掃描顯微鏡分析細胞自噬水平變化;Western blot檢測4-HNE、HO-1、NQO1、GCLM、Nrf2、Bax、Bcl-2、Beclin1蛋白表達水平，從氧化應激、細胞凋亡、細胞自噬等多條途徑探討SchB防治CsA腎毒性的可能機制，為臨床二藥聯(lián)用應用提供實驗依據(jù)。
　　結果:
　　1.建立全血樣品中CsA的LC/MS/MS分析方法，該方法采用多反應監(jiān)測定量Cs

9、A原型藥物濃度，其結果不受CsA代謝物的影響。方法學考察的專屬性、線性范圍、基質效應、提取回收率、精密度、穩(wěn)定性均符合生物樣品檢測指導原則要求，適用于臨床上監(jiān)測CsA血藥濃度，指導臨床上CsA的合理使用劑量，進而減少CsA的毒副作用的發(fā)生。
　　2.運用建立的全血樣本中CsA的LC/MS/MS分析方法，考察了五味子提取物與CsA聯(lián)合用藥時對CsA在大鼠體內藥動學的影響。結果表明:
　　①單獨給予25mg/kgCsA，其藥代動

10、力學參數(shù)為:Cmax為2608±585.89ng/mL; Tmax為6.33±1.50h; t1/2為19.92±6.43h; AUC0→∞為82851.36±16615.30ng h/mL;
　　②單次灌服給予54mg/kg SCE后同時給藥25mg/kg CsA，其其Cmax為3456.674±251.89ng/mL; Tmax為6.8±1.10h;t1/2為29.66±14.27h;AUC0→∞為132564.2±50934

11、.74 ngh/mL;
　?、蹎未喂喾o予108mg/kg SCE后同時給藥25mg/kg CsA后，其Cmax為3026.806±409.61 ng/mL;Tmax為8.67±1.63h;t1/2為28.44±9.00h;AUC0→∞為114030.90±21573.65ngh/mL;
　　④單次灌服給予216mg/kg SCE后同時給藥25mg/kg CsA后，其Cmax為3286.45±1418.41 ng/mL; T

12、max為13.5±7.55 h; t1/2為34.94±12.67h;AUC0→∞為173777.70±95727.64;
　　以上結果說明，大鼠灌服不同濃度的SCE后，其藥動參數(shù)與單獨給予CsA組相比較有明顯的提高或延長，提示CsA聯(lián)合五味子用藥時，五味子可改變CsA體內藥動學行為，即聯(lián)合用藥時，可以通過減少CsA用量而仍達到治療濃度的目的，從而減少副作用和經(jīng)濟負擔。
　　3.連續(xù)灌胃給藥28天后，與25mg/kg CsA

13、組相比較，SCE可以改善大鼠體重下降;降低血清中肌酐、尿素氮含量和腎臟組織中丙二醛水平;升高腎臟組織中的CAT和GSH-Px的活性;減輕CsA引起的腎小管萎縮壞死，炎癥細胞浸潤以及腎小管間質纖維化，說明SCE可以有效的降低CsA引起的腎臟毒性。同時，SCE可以上調HO-1、Nrf2、P-gp蛋白表達，下調4-HNE、Bcl-2、Cleaved caspase3和LC3A/B蛋白表達，提示SCE可能是通過降低腎臟氧化應激、凋亡因子、自噬水

14、平，繼而防治CsA致腎臟損傷。
　　4.HK-2細胞實驗結果表明:①CsA以劑量-時間依賴性降低HK-2細胞存活率;當給予不同濃度SchB(2.5、5.0、10.0μM)配伍10μM CsA干預處理HK-2細胞24h后，細胞的存活率明顯提高，乳酸脫氫酶(LDH)漏出率和細胞內活性氧(ROS)水平顯著降低;細胞內還原性谷胱甘肽(GSH)提高;下調4-HNE蛋白表達;說明SchB干預處理HK-2細胞，能顯著的抑制CsA引起氧化性損傷，

15、繼而保護細胞。②AnnexinⅤ-FITC/PI雙染結果顯示CsA以劑量-時間依賴性誘導細胞凋亡;當與10μM CsA組相比，用2.5、5.0、10.0μM SchB干預處理HK-2細胞后，細胞凋亡率分別顯著降低至18.12％、16.80％、15.25％;另一方面，SchB干預后，能顯著增加CsA引發(fā)的線粒體膜電位的下降;Western blot檢測Bax蛋白表達降低，Bcl-2蛋白表達升高;說明SchB干預處理保護CsA引起細胞凋亡有

16、可能通過線粒體調節(jié)內源性途徑抑制細胞凋亡。③Cyto-ID(@)綠色染料單染顯示CsA以劑量-時間依賴性誘導細胞發(fā)生自噬;但當給予SchB干預作用后，細胞的自噬的水平受到明顯的抑制;進一步采用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察自噬溶酶體綠色熒光斑點聚集情況，發(fā)現(xiàn)單獨CsA處理作用的HK-2細胞周圍存在強度明顯的綠色熒光斑點聚集，當SchB干預后，明顯減少綠色斑點聚集，;同時觀察在SchB處理后，自噬標記蛋白Beclin1表達下降，提示SchB處理

17、抑制CsA誘導自噬的發(fā)生。④研究還發(fā)現(xiàn)，SchB干預處理，能顯著促進Nrf2核轉位，并進一步激活其下游Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因HO-1、NQO1、GCLM蛋白表達，提示說明SchB能通過激活Nrf2/ARE信號通路，防治CsA引起腎臟細胞氧化應激損傷。
　　結論:
　　五味子木脂素可增加CsA在大鼠體內的藥物濃度，并可防治CsA引發(fā)的腎臟毒性，其機制可能與降低ROS水平，穩(wěn)定線粒體膜，調控Nrf2通路發(fā)揮抗氧化作用;并通過線