牙齦卟啉單胞菌HA2、fimA基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其表達的研究.pdf

1、目的：以牙齦卟啉單胞菌牙齦素-血凝素基因編碼區(qū)的核心功能區(qū) HA2和菌毛蛋白基因fimA為目的基因，以SD大鼠IL-15基因為免疫佐劑，構(gòu)建穩(wěn)定高效的真核表達質(zhì)粒pVAX1-HA2-fimA/IL-15、pVAX1-HA2/IL-15、pVAX1-HA2-fimA、pVAX1-fimA/IL-15和pVAX1-HA2，體外實驗觀察目的基因HA2、fimA和佐劑基因IL-15 mRNA水平的表達及免疫佐劑IL-15蛋白的表達，為下一步實驗

2、提供實驗基礎和物質(zhì)條件。
　　方法：本實驗共分為三部分：
　　第一部分：真核表達質(zhì)粒 pVAX1-HA2-fimA/IL-15、 pVAX1-HA2/IL-15、pVAX1-HA2-fimA、pVAX1-fimA/IL-15、pVAX1-HA2的構(gòu)建
　　1.牙齦卟啉單胞菌的總DNA的提取、SD大鼠的總RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄，獲得目的基因 HA2、fimA、IL-15基因及 IRES序列，二次拼接將基因串聯(lián)獲得HA2-f

3、imA/IL-15、HA2/IL-15、HA2-fimA、fimA/IL-15、HA2片段，同時插入酶切位點XhoI、NheI。
　　2.目的片段HA2-fimA/IL-15、HA2/IL-15、HA2-fimA、fimA/IL-15、HA2以及載體pVAX1的XhoI、NheI雙酶切。
　　3.將pVAX1片段與目的片段HA2-fimA/IL-15、HA2/IL-15、HA2-fimA、fimA/IL-15、HA2進行拼接

4、獲得陽性克隆，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，同時進行測序鑒定。
　　第二部分：重組質(zhì)粒在真核細胞中mRNA水平的檢測
　　1.人源腎上皮細胞293T細胞的培養(yǎng)
　　2.重組質(zhì)粒 pVAX1-HA2-fimA/IL-15、pVAX1-HA2/IL-15、pVAX1-HA2-fimA、pVAX1-fimA/IL-15、pVAX1-HA2轉(zhuǎn)染293T細胞，同時設計空白對照組，轉(zhuǎn)染24h后提取293T細胞的總RNA，進

5、行逆轉(zhuǎn)錄。
　　3.分別根據(jù)目的基因的序列設計特異性引物，PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳驗證其大小，擴增產(chǎn)物同時進行測序，結(jié)果進行BLAST比對。
　　第三部分：重組質(zhì)粒pVAX1-HA2-fimA/IL-15、pVAX1-HA2/IL-15、pVAX1-fimA/IL-15在真核細胞中IL-15蛋白表達水平的檢測
　　1.293T細胞的培養(yǎng)及重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞
　　2. ELISA定量檢測IL-15表達量

6、r>　?。?）293T細胞總蛋白及上清蛋白的收集
　?。?）IL-15蛋白標準曲線的繪制及待測蛋白的檢測，并對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學分析。
　　結(jié)果：
　　1.重組質(zhì)粒 pVAX1-HA2-fimA/IL-15、pVAX1-HA2/IL-15、pVAX1-HA2-fimA、pVAX1-fimA/IL-15和pVAX1-HA2經(jīng)酶切及測序鑒定，目的基因HA2、fimA及IL-15定向插入至真核表達質(zhì)粒pVAX1，中間連接IR

7、ES序列與設計一致，插入位置正確，目的基因讀碼框未發(fā)生改變。
　　2.五個重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293T細胞，RT-PCR擴增目的基因 HA2、fimA、IL-15，可見單一目的條帶，大小與預計相同，測序結(jié)果與NCBI進行BLAST比對，與已公布的基因序列相同。
　　3.繪制出 IL-15的標準曲線，并檢測出 IL-15表達量，結(jié)果表明pVAX1-HA2-fimA/IL-15、pVAX1-HA2/IL-15、pVAX1-fimA/

8、IL-15與pVAX1陰性對照組及空白對照組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（p﹤0.05）。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建真核表達質(zhì)粒 pVAX1-HA2-fimA/IL-15、pVAX1-HA2/IL-15、pVAX1-HA2-fimA、pVAX1-fimA/IL-15、pVAX1-HA2，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染真核細胞293T細胞后，RT-PCR證實目的基因在 mRNA水平能夠被正確表達，ELISA證實重組質(zhì)粒pVAX1-HA2-fimA/IL-15