雞降鈣素基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其在蛋雞體內(nèi)的表達研究.pdf

1、降鈣素是動物體內(nèi)鈣磷調(diào)節(jié)的主要激素之一.降鈣素的主要生理作用是抑制破骨細胞來調(diào)節(jié)人和動物體內(nèi)鈣的代謝.因此被廣泛的應(yīng)用于治療各骨病例如Paget氏病和各種原因引起的高血鈣癥以及原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥.但是由于現(xiàn)在臨床上用的降鈣素大都是鮭魚或者豬的組織提取出來的,所以一般價格昂貴.盡管現(xiàn)在利用基因工程技術(shù)將降鈣素基因在原核細胞中進行表達,但在實際應(yīng)用中還具有非常大的局限性.因此,該研究擬利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建雞降鈣素基因的真核表達質(zhì)粒,在雞體內(nèi)

2、進行表達并以此來對禽體內(nèi)鈣的營養(yǎng)調(diào)控機制進行研究,并進一步尋找利用基因注射來解決生產(chǎn)中由于的鈣的營養(yǎng)不足而引起的各種缺乏癥的可行性.該研究就是通過已知的雞降鈣素基因序列設(shè)計引物,用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)擴增出雞降鈣素cDNA,將其插入真核表達載體pCEP4和pcDNA3中構(gòu)建雞降鈣素基因的真核表達質(zhì)粒,經(jīng)酶切和PCR鑒定,確定得到了cCT的真核表達重組質(zhì)粒pCEP4-CT和pcDNA3-CT.將獲得的兩種真核表達質(zhì)粒純化后對蛋雞進行腿部肌肉

3、注射,兩周后進行重復(fù)一次,并每兩周都取血液樣品,對血液中的降鈣素、甲狀旁腺素、雌二醇及其血鈣血磷進行測定分析,根據(jù)體內(nèi)降鈣素以及其他相關(guān)的激素和生理指標的變化來檢驗兩個重組的真核表達質(zhì)粒在蛋雞體內(nèi)的表達情況.通過該次實驗得到的結(jié)果顯示:1、擴增出來的cDNA,通過序列測定結(jié)果表明和國外已經(jīng)發(fā)表的雞的降鈣素cDNA序列僅有一個核苷酸的差別,中間沒有缺失和插入的現(xiàn)象.證明所得到的是雞的降鈣素cDNA.2、所獲得的雞降鈣素cDNA分別連入真核

4、表達載體pCEP4和pcDNA3中,對篩選出的質(zhì)粒進行酶切和PCR鑒定,證明得到了重組的雞降鈣素基因真核表達質(zhì)粒.3、蛋雞體內(nèi)表達實驗結(jié)果表明注射所構(gòu)建的兩種重組雞降鈣素質(zhì)粒后,和對照組相比血液中的降鈣素顯著的上升(p<0.05),血鈣有明顯的下降而甲狀旁腺素、雌二醇以及血磷則都有明顯的增高趨勢.結(jié)果表明所構(gòu)建的質(zhì)粒在蛋雞體內(nèi)的作用效果明顯.4、同時在實驗中證明,所構(gòu)建的兩個真核表達質(zhì)粒pCEP4-cCT和pcDNA3-cCT相比較,前