差異蛋白質(zhì)組學(xué)在Poly(I-C)誘導(dǎo)的大黃魚肝臟中的研究及兩種免疫相關(guān)基因的克隆和鑒定.pdf

1、大黃魚(Pseudosciana crocea)是我國(guó)特有的經(jīng)濟(jì)魚種,以其味道鮮美,營(yíng)養(yǎng)豐富和極高的藥用價(jià)值而受到青睞,在大黃魚人工育苗和網(wǎng)箱養(yǎng)殖等技術(shù)相繼成熟之后,人工養(yǎng)殖得到迅猛發(fā)展。由于養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大和養(yǎng)殖環(huán)境日益惡化,導(dǎo)致大面積病毒性疾病的爆發(fā),給大黃魚的養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失。在本研究中,我們利用蛋白質(zhì)組學(xué)的高通量高分辨力對(duì)對(duì)照組和Poly(I:C)注射組的大黃魚肝臟樣品做進(jìn)一步研究,旨在從分子水平角度對(duì)魚類的抗病機(jī)制做初

2、步的探索。通過比較對(duì)照組和注射組肝臟樣品的雙向電泳圖譜,我們?cè)诟闻K樣品找到30個(gè)差異點(diǎn),并利用MALDI-TOF-MS做肽質(zhì)量指紋圖譜分析,進(jìn)一步對(duì)其中16個(gè)差異點(diǎn)做串聯(lián)質(zhì)譜MALDI-TOF-TOF分析,得到了13個(gè)點(diǎn)的肽段。在對(duì)大黃魚抗病機(jī)制的研究中,我們查詢這些差異點(diǎn)的功能發(fā)現(xiàn),有13.3％的差異點(diǎn)是免疫相關(guān)蛋白,40％的差異點(diǎn)是代謝酶類,10％的差異點(diǎn)是調(diào)控蛋白類,13.3％的差異點(diǎn)是轉(zhuǎn)錄/翻譯蛋白類,13.3％的差異點(diǎn)是結(jié)構(gòu)蛋

3、白類,10％的差異點(diǎn)功能未知。
　　 在人的細(xì)胞中,干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白1是一個(gè)蛋白復(fù)合物的組分,該復(fù)合物與同型粘連和抗增殖信號(hào)的轉(zhuǎn)換密切相關(guān)。在本研究中,克隆了大黃魚IFITM1基因全長(zhǎng)734個(gè)核苷酸的cDNA序列,它編碼124個(gè)氨基酸的蛋白,分子量為13.6 KD。推測(cè)的蛋白與哺乳動(dòng)物和魚類已知的干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白有較高的同源性,并且有IFITM典型的結(jié)構(gòu)特征,包括兩個(gè)保守的跨膜區(qū)和它們之間的胞內(nèi)區(qū),一個(gè)位于胞內(nèi)區(qū)的保守的PK

4、C磷酸化位點(diǎn)(aa65-67,SIR)。進(jìn)化分析顯示LycIFITM1與魚類IFITM形成獨(dú)立一支。組織表達(dá)分布研究顯示LycIFITM1基因在所檢測(cè)的所有組織中都有表達(dá),包括腸、鰓、心、肌、脾、肝、血和腎。經(jīng)Poly(I:C)誘導(dǎo)24小時(shí)后IFITM1在鰓、腎、心和脾中表達(dá)明顯上調(diào),揭示LycIFITM1可能與Poly(I:C)刺激產(chǎn)生的免疫反應(yīng)有關(guān)。,熒光定量PCR結(jié)果顯示:在Poly(I:C)刺激下LycIFITM1的mRNA在脾

5、臟和腎臟的轉(zhuǎn)錄水平都在24小時(shí)達(dá)到最高,分別是正常水平的48.7和280.4倍。以上結(jié)果說(shuō)明LycIFITM1基因是魚類IFITM家族的成員。
　　 在本研究中,克隆了大黃魚CXCL12基因全長(zhǎng)678個(gè)核苷酸的cDNA序列,它編碼97個(gè)氨基酸的蛋白,分子量為11.1KD,包含一個(gè)22個(gè)氨基酸的信號(hào)肽和75個(gè)氨基酸的成熟肽。四個(gè)半胱氨酸殘基是CXC趨化因子空間結(jié)構(gòu)和功能所必需的,LycCXCL12蛋白含有這4個(gè)保守的半胱氨酸殘基(

6、在第31,33,56和71位)。推斷的蛋白和其他已知的魚類CXCL12趨化因子有57％-68％的同源性,和其他脊椎動(dòng)物有32％-36％的同源性。進(jìn)化分析顯示LycCXCL12和CXCL12亞族的關(guān)系最近。組織表達(dá)分布研究顯示LycCXCL12基因在所檢測(cè)的所有組織中都有表達(dá),包括腸、鰓、心、肌、脾、肝、血和腎。經(jīng)Poly(I:C)和三聯(lián)滅活細(xì)菌疫苗誘導(dǎo)24小時(shí)后,LycCXCL12基因在鰓、肝、腎、血和脾中表達(dá)明顯上調(diào),三聯(lián)疫苗刺激引起