大黃素聯(lián)合KGF與HIF-1α在低氧細(xì)胞應(yīng)激損傷中的自噬機(jī)制研究.pdf

1、目的：采用傳統(tǒng)中藥提取物結(jié)合基因治療的策略，用于保護(hù)低氧環(huán)境下?lián)p傷的腸粘膜，改善腸粘膜屏障的結(jié)構(gòu)和功能。本實(shí)驗(yàn)以大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞（IEC-6）為體外模型，使用大黃素聯(lián)合低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxiainducible factor-1α，HIF-1α）和角質(zhì)細(xì)胞生長因子（keratinocyte growth factor，KGF），建立新的治療方案，明確其在低氧所致腸應(yīng)激損傷中通過細(xì)胞自噬機(jī)制起保護(hù)作用。
　　方法：1.

2、通過MTT法篩選大黃素最佳作用濃度；2.用攜帶GFP熒光蛋白基因的腺病毒轉(zhuǎn)染IEC-6細(xì)胞，測定最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)（multiplicityofy infection，MOI）；3.分為四組：對照組，細(xì)胞因子組（攜帶雙基因HIF-1α和KGF組），大黃素組，大黃素聯(lián)合細(xì)胞因子組（攜帶雙基因HIF-1α和KGF聯(lián)合大黃素組），各組分別作用相應(yīng)藥物；4.在低氧0小時(shí)、6小時(shí)、24小時(shí)分別MTT法檢測細(xì)胞生存率、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期；5.在低氧6

3、小時(shí)、24小時(shí)分別行透射電鏡觀察自噬體的出現(xiàn)、Real time-PCR檢測自噬相關(guān)基因（Beclin-1、LC3）、Western-blot法檢測自噬相關(guān)蛋白（Beclin-1、LC3）；6.攜帶HIF-1α和KGF兩種基因的腺病毒轉(zhuǎn)染IEC-6細(xì)胞，用Real time-PCR法、免疫熒光法、Western-blot蛋白印記法檢測細(xì)胞因子組和大黃素聯(lián)合細(xì)胞因子組在低氧0小時(shí)、6小時(shí)、24小時(shí)兩種外源基因（HIF-1α、KGF）的表達(dá)

4、。
　　結(jié)果：1.大黃素在濃度為5μmol/L時(shí)具有明顯促進(jìn)細(xì)胞生長作用；2.根據(jù)攜帶GFP熒光蛋白基因的腺病毒轉(zhuǎn)染IEC-6檢測熒光表達(dá)率與相應(yīng)MTT實(shí)驗(yàn)可得到腺病毒的最佳MOI為100；攜帶HIF-1α和KGF的腺病毒按照最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)轉(zhuǎn)染IEC-6；3.MTT法可得出在低氧條件下，大黃素聯(lián)合細(xì)胞因子組對IEC-6細(xì)胞有較好的保護(hù)作用，細(xì)胞周期結(jié)果顯示細(xì)胞因子可明顯阻滯細(xì)胞在G1期（P<0.01），大黃素可明顯促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入分裂期

5、（P<0.01），大黃素聯(lián)合細(xì)胞因子組可促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期（P<0.01），因此，大黃素促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入分裂期作用大于細(xì)胞因子阻滯細(xì)胞作用，大黃素聯(lián)合細(xì)胞因子組有明顯的促細(xì)胞生長作用。4.電鏡下可見低氧6小時(shí)、24小時(shí)各組細(xì)胞均可見自噬小體出現(xiàn)；Real time-PCR檢測與常氧對照組相比，低氧6小時(shí)、24小時(shí)后自噬相關(guān)基因Beclin-1及LC3表達(dá)量均上調(diào)（P<0.01），其中自噬相關(guān)基因Beclin-1、LC3在低氧6小時(shí)的表達(dá)較24

6、小時(shí)基因表達(dá)明顯增多（P<0.05），且大黃素聯(lián)合細(xì)胞因子組較大黃素組、細(xì)胞因子組及對照組組表達(dá)增多（P<0.05）；Western-blot結(jié)果提示低氧6、24小時(shí)后，Beclin-1與LC3蛋白均有表達(dá)，大黃素聯(lián)合細(xì)胞因子組較大黃素組、細(xì)胞因子組及對照組表達(dá)增多（P<0.05）。5.Real time-PCR法及免疫熒光法檢測HIF-1α及KGF兩種外源基因在低氧0、6、24小時(shí)在IEC-6細(xì)胞內(nèi)均穩(wěn)定表達(dá)；Western-blot

7、結(jié)果提示腺病毒攜帶的基因在轉(zhuǎn)入細(xì)胞后HIF-1α蛋白穩(wěn)定表達(dá)，在常氧對照組及低氧各組表達(dá)中無明顯差異（P>0.05）。
　　結(jié)論：1.大黃素聯(lián)合細(xì)胞因子在低氧條件下，可通過增強(qiáng)細(xì)胞的自噬機(jī)制對細(xì)胞起保護(hù)作用。2.大黃素聯(lián)合細(xì)胞因子（HIF-1α和KGF）較單用大黃素或細(xì)胞因子促進(jìn)自噬相關(guān)基因的激活及蛋白的表達(dá)作用更為明顯。3.攜帶兩種基因的腺病毒可穩(wěn)定安全的將HIF-1α和KGF外源基因轉(zhuǎn)染入細(xì)胞內(nèi)部，并且在核酸水平及蛋白水平穩(wěn)定