低氧誘導(dǎo)的自噬在肝癌細(xì)胞化療抗性中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌是嚴(yán)重危害人類(lèi)生命健康的重大疾病之一，其惡性程度高，發(fā)展迅速，容易復(fù)發(fā)。化療是目前治療腫瘤的三大手段之一，但原發(fā)性肝癌化療的療效并不理想，主要原因在于肝癌對(duì)化療不敏感，其機(jī)制還不清楚。目前多使用肝動(dòng)脈化療栓塞(TACE)進(jìn)行局部化療，并已經(jīng)成為目前不能切除肝癌治療的首選。肝癌是一種高代謝的腫瘤，耗氧量高于正常組織，并且腫瘤內(nèi)血管結(jié)構(gòu)和功能的異?？芍履[瘤細(xì)胞血供和氧供減少，故肝癌組織處于低氧環(huán)境。而TACE栓塞了腫瘤動(dòng)脈血供，會(huì)

2、進(jìn)一步加重肝癌的缺血缺氧。低氧導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄活性發(fā)生改變，啟動(dòng)一系列應(yīng)激反應(yīng)，使腫瘤細(xì)胞逃逸凋亡。 肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物作用的抵抗，正是由于化療藥物不能有效地誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡，部分肝癌細(xì)胞存活下來(lái)成為殘留腫瘤細(xì)胞。而殘存的細(xì)胞大都為低氧細(xì)胞，成為復(fù)發(fā)和(或)轉(zhuǎn)移的根源。故腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的抗拒性增加是其逃逸凋亡的表現(xiàn)。低氧可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的抵抗，但具體機(jī)制目前尚不明確。 研究證實(shí)低氧可以誘發(fā)細(xì)胞自噬。自噬是

3、細(xì)胞利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過(guò)程，生命體借此維持蛋白代謝平衡及細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。自噬作為一種防御機(jī)制，在細(xì)胞饑餓、生長(zhǎng)因子缺乏特別是缺氧條件下對(duì)維持細(xì)胞的存活、免于凋亡有積極作用。 所以，低氧環(huán)境中肝癌細(xì)胞的凋亡逃逸乃至對(duì)化療藥物的抵抗極有可能由自噬介導(dǎo)。為證實(shí)這一猜想，本課題從以下三個(gè)方面進(jìn)行研究：第一部分研究低氧對(duì)肝癌細(xì)胞化療敏感性的影響；第二部分研究低氧誘發(fā)細(xì)胞自噬在肝癌細(xì)胞化療抗性中的作用，從而在細(xì)胞

4、水平探討低氧介導(dǎo)肝癌細(xì)胞化療抗性的作用機(jī)制；第三部分研究低氧、自噬和細(xì)胞凋亡相關(guān)分子之間的關(guān)系，從分子水平探討低氧誘發(fā)自噬介導(dǎo)肝癌細(xì)胞化療不敏感的作用機(jī)制。 第一部分低氧環(huán)境對(duì)肝癌細(xì)胞化療敏感性的影響 首先應(yīng)用不同劑量的化療藥物：cisplatin、epirubicin、mitomycin和gemcitabine，處理肝癌細(xì)胞SMMC-7721不同時(shí)間，觀察不同化療藥物對(duì)肝癌細(xì)胞存活的影響以及這些化療藥物的細(xì)胞毒性和劑量

5、、時(shí)間之間的依賴關(guān)系；其次根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果在1％O2的低氧條件下選用合適的藥物作用濃度和藥物作用時(shí)間，處理肝癌細(xì)胞：SMMC-7721和HepG2，觀察在1％O2的低氧和20％O2的常氧條件下，化療藥物造成的細(xì)胞毒性之間的差異。結(jié)果提示，在一定的藥物作用濃度下，化療藥物處理肝癌細(xì)胞一定時(shí)間后，在低氧培養(yǎng)環(huán)境中造成的細(xì)胞死亡率明顯低于常氧，低氧環(huán)境中的肝癌細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的化療抗性，而且這種化療抗性普遍存在于各種化療藥物處理的肝癌細(xì)胞中，而

6、不是某種化療藥物特異的，結(jié)果提示低氧環(huán)境中肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的抵抗作用可能存在普遍性。 第二部分低氧誘導(dǎo)的自噬在肝癌細(xì)胞化療抗性中的作用 本部分實(shí)驗(yàn)擬從細(xì)胞水平探討低氧是通過(guò)哪種機(jī)制介導(dǎo)肝癌細(xì)胞的化療抗性的?；熕幬镏饕ㄟ^(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮其抗腫瘤作用。而低氧容易引起細(xì)胞周期阻滯。那么，低氧是否是通過(guò)影響肝癌細(xì)胞的凋亡來(lái)影響化療藥物的作用效果?本研究中低氧介導(dǎo)的肝癌細(xì)胞化療抗性是否與細(xì)胞周期阻滯相關(guān)呢?于是，我們分別在1

7、％O2和20％O2中培養(yǎng)肝癌細(xì)胞SMMC-7721，同時(shí)化療藥物處理，通過(guò)DAPI染色從形態(tài)學(xué)上觀察細(xì)胞凋亡的改變，通過(guò)PI-AnnexinV染色流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)細(xì)胞凋亡，PI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞的周期分布情況，從而探討低氧介導(dǎo)的肝癌細(xì)胞化療抵抗與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期分布之間的關(guān)系。形態(tài)學(xué)和流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞凋亡的定量分析結(jié)果均顯示，與常氧條件下化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相比，低氧條件下化療藥物處理后肝癌細(xì)胞的凋亡率明顯降低；而且兩組細(xì)胞的

8、細(xì)胞周期分布情況相似，無(wú)顯著性差異，提示本研究中肝癌細(xì)胞的化療抗性與細(xì)胞周期阻滯之間無(wú)明顯相關(guān)性；由此可見(jiàn)低氧條件下肝癌細(xì)胞的化療抗性是由于細(xì)胞凋亡能力的降低，而這并不是由細(xì)胞周期阻滯介導(dǎo)的。 那么，是什么機(jī)制使低氧環(huán)境中細(xì)胞的凋亡能力降低呢?有研究顯示，自噬可以增強(qiáng)細(xì)胞在不利環(huán)境中的生存能力，于是我們向肝癌細(xì)胞SMMC-7721和HepG2中轉(zhuǎn)染可以表達(dá)自噬標(biāo)志性分子LC3的質(zhì)粒--GFP-LC3，然后分別置1％和20％O2中

9、培養(yǎng)，將前部分研究結(jié)果顯示的低氧環(huán)境中肝癌細(xì)胞化療抗性最明顯的cisplatin(20μM)處理組作為研究對(duì)象，熒光顯微鏡下觀察GFP-LC3的表達(dá)間接檢測(cè)自噬的發(fā)生情況；為了進(jìn)一步明確自噬是否參與了低氧環(huán)境中肝癌細(xì)胞的化療抵抗，我們還應(yīng)用自噬抑制劑3-MA作用于肝癌細(xì)胞，然后檢測(cè)自噬被抑制前后細(xì)胞凋亡的改變，從而探討自噬在低氧介導(dǎo)的肝癌細(xì)胞化療抗性中的作用。熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，低氧培養(yǎng)后的肝癌細(xì)胞中可以看到大量點(diǎn)狀綠色熒光分布，而常

10、氧培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞中很少或幾乎看不到，證明白噬不能被常氧所誘導(dǎo)，誘導(dǎo)明顯的自噬的發(fā)生。而且自噬抑制劑--3-MA可以有效地抑制肝癌細(xì)胞的自噬，因?yàn)榧词故窃诘脱醐h(huán)境中，3-MA處理后肝癌細(xì)胞中只有少量的點(diǎn)狀綠色熒光。對(duì)3-MA處理前后細(xì)胞凋亡的分析顯示，低氧環(huán)境中細(xì)胞的自噬被抑制后，化療藥物誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡明顯增加，與常氧條件下化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率相當(dāng)，提示可能是自噬促進(jìn)了肝癌細(xì)胞在低氧環(huán)境中的生存，抑制了細(xì)胞凋亡，從而介導(dǎo)低氧條件下

11、肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的抵抗。 第三部分低氧誘導(dǎo)自噬增強(qiáng)肝癌細(xì)胞化療抗性相關(guān)分子的檢測(cè) 在本部分實(shí)驗(yàn)中，我們首先應(yīng)用Western Blotting檢測(cè)常氧與低氧條件下HIF-1α蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)1％O2可以誘導(dǎo)HIF-1α蛋白表達(dá)的上調(diào)，而20％O2環(huán)境中幾乎檢測(cè)不到HIF-1α的表達(dá)；其次，構(gòu)建HIF-1α特異的siRNA并轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞SMMC-7721，然后分別應(yīng)用Western Blotting和Realtime-P

12、CR檢測(cè)HIF-1α和自噬相關(guān)基因Atg5的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HIF-1α被抑制后Atg5mRNA的表達(dá)明顯降低；同時(shí)熒光顯微鏡下觀察LC3Ⅱ的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，HIF-1α被抑制后LC3Ⅱ的表達(dá)明顯減少；結(jié)果提示，HIF-1α可能參與了低氧誘導(dǎo)的自噬的調(diào)控；最后通過(guò)檢測(cè)低氧和常氧以及siRNA-HIF-1α作用前后caspase3的表達(dá)，從分子水平探討低氧對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，與常氧條件下化療藥物作用后caspase3的表達(dá)量相比，低氧環(huán)境中c

13、aspase3的表達(dá)量明顯降低，但是低氧條件下HIF-1α的表達(dá)被抑制后，caspase3的表達(dá)量上調(diào)，而且與常氧化療后caspase3的表達(dá)量相當(dāng)。這些結(jié)果初步闡明了低氧介導(dǎo)的肝癌細(xì)胞化療抵抗的分子作用途徑，提示低氧可能是通過(guò)上調(diào)HIF-1α的表達(dá)激活HIF-1，HIF-1發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄因子的作用促進(jìn)自噬相關(guān)分子Atg的表達(dá)，然后再直接或間接地抑制凋亡關(guān)鍵分子caspases的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡，介導(dǎo)肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的抵抗。這為自噬

14、參與低氧介導(dǎo)的肝癌細(xì)胞化療抗性分子機(jī)制的深入研究奠定了基礎(chǔ)，為針對(duì)肝癌組織中處于低氧微環(huán)境腫瘤細(xì)胞的治療新方法的探索提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 綜上所述，我們的研究結(jié)果提示如下結(jié)論： 1.低氧可在一定程度增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的化療抗性，該研究結(jié)果提示腫瘤生長(zhǎng)及TACE治療造成的局部低氧環(huán)境可能影響化療效果。 2.低氧可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生自噬，而正是自噬介導(dǎo)了低氧條件下肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的抵抗，低氧誘導(dǎo)的自噬被抑制后，肝癌細(xì)胞的化療