基于α-葡萄糖苷酶三維結(jié)構(gòu)的分子設(shè)計及其突變體在大腸桿菌中的高效表達.pdf

1、目的：使用PCR技術(shù)獲得α-葡萄糖苷酶基因序列，通過SWISS-MODEL服務器對α-葡萄糖苷酶結(jié)構(gòu)進行預測，結(jié)合氨基酸的性質(zhì)特點，對酶蛋白進行分子設(shè)計，采用PCR突變試劑盒對其進行定點突變，并在大腸桿菌中表達，測定了重組菌、突變菌的酶活力，為進一步研究α-葡萄糖苷酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。 方法：根據(jù)GenBank中登錄的α-葡萄糖苷酶的核酸序列設(shè)計PCR引物，并在上游引物的5'端加上EcoRⅠ酶切位點，在下游引物的5'端

2、加上HindⅢ酶切位點。從嗜熱脂肪芽孢桿菌U2中提取基因組DNA，應用PCR擴增出α-葡萄糖苷酶的核酸序列與pUC18經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切，連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)藍白篩選，挑出陽性菌落，抽提重組質(zhì)粒鑒定后測序，測序正確后將陽性重組質(zhì)粒和表達載體pGEMEX-1經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切，連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21pLysS，經(jīng)篩選后挑取菌落，抽提重組質(zhì)粒鑒定后測序，軟件模擬α-葡萄糖苷酶蛋白結(jié)構(gòu)，尋找合適的突變位點，

3、設(shè)計突變引物，用突變試劑盒對α-葡萄糖苷酶蛋白序列的203、258位進行突變，表達突變體。將克隆重組菌株、表達重組菌株和突變重組菌株的酶活力進行測定比較。同時將陽性菌落用IPTG誘導表達3小時，全菌體蛋白SDS-PAGE電泳觀察表達結(jié)果。 結(jié)果：1.經(jīng)PCR技術(shù)自嗜熱脂肪芽孢桿菌U2基因組DNA中克隆了編碼α-葡萄糖苷酶的基因，測序結(jié)果與Genbank上登錄的相應基因一致。 2.使用瑞士日內(nèi)瓦生物醫(yī)學研究所的SWISS-

4、MODEL服務器預測了α-葡萄糖苷酶的三維結(jié)構(gòu)，并使用SWISSPDBViewer構(gòu)建突變體模型，使用評估軟件對模型結(jié)構(gòu)分析，達到合理化結(jié)果。 3.本研究使用TaKaRaMutanBESTKit將258位與203位氨基酸定點突變，達到預期突變結(jié)果。 4.構(gòu)建的表達體系轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21pLysS，抽提重組質(zhì)粒鑒定，測序結(jié)果表明連接方向正確，可以進行誘導表達。 5.經(jīng)過酶活力檢測，在表達重組體比出發(fā)菌株產(chǎn)酶活力提