天花粉蛋白基因的克隆及其突變體在大腸桿菌中的表達(dá).pdf_第1頁(yè)
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1、目的:天花粉蛋白(TCS)是一種單鏈核糖體失活蛋白,它能抑制真核生物蛋白質(zhì)合成,并具有廣譜的抗病毒活性。近期研究發(fā)現(xiàn)TCS可專(zhuān)一性地殺死被HIV感染的細(xì)胞,而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)作用。本實(shí)驗(yàn)利用PCR技術(shù)從栝樓基因組DNA中擴(kuò)增出TCS基因,成功構(gòu)建了克隆載體和表達(dá)載體,并建立了TCS隨機(jī)突變文庫(kù),這為T(mén)CS的原核表達(dá)奠定了分子生物學(xué)的基礎(chǔ)。 方法: 1).從新鮮栝樓葉片中獲取TCS基因組DNA,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增其全長(zhǎng)基因,與

2、載體pUCm-T連接,轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5a,提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序; 2).用PCR法克隆TCS成熟肽基因(CDS),經(jīng)NcoⅠ和HindⅢ雙酶切后連接經(jīng)同樣雙酶切的pET-28a(+)載體,轉(zhuǎn)化Ecoli DH5a,陽(yáng)性鑒定后將所獲陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)Ecoli BL21(DE3)得到工程菌,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析; 3).采用易錯(cuò)PCR技術(shù)構(gòu)建TCS基因和活性中心隨機(jī)突變文庫(kù)

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