天花粉蛋白抗腫瘤作用的分子機理研究.pdf

1、天花粉蛋白(trichosanthin，TCS)是從葫蘆科植物栝樓(TrichosantheskirilowiiMaxim)的塊根中提取的一種蛋白質，為我國傳統(tǒng)中藥"天花粉"的有效成分，它具有引產、抗腫瘤和抗HIV病毒等多種生物學功能。 TCS屬于單鏈核糖體失活蛋白(ribosomeinactivatingprotein，RIP)，以往的研究主要集中在結構和藥理作用方面，對其引起細胞凋亡和信號轉導的分子機制研究得較少。為了更好地

2、進行臨床應用，有必要對天花粉蛋白的抗腫瘤作用機理進行深入研究。 研究目的通過現代細胞和分子生物學的方法，深入研究TCS引起的腫瘤細胞凋亡和信號轉導過程的規(guī)律，揭示其抗腫瘤作用的分子機理。 研究方法： 第一部分：天花粉蛋白對腫瘤細胞凋亡和周期阻滯的影響首先采用流式細胞術，以體外培養(yǎng)的鼠成纖維肉瘤細胞L929為對象，研究TCS對腫瘤細胞周期抑制作用；采用MTT法，在體外測定了TCS對Hela、Hep-G2、HCT11

3、6、Colo205等腫瘤細胞的細胞毒性。為了證實TCS引起細胞凋亡，利用Westernblot方法檢測了細胞凋亡過程中Caspase3和其它信號分子如PARP和JNK的激活情況，以本實驗室表達的TCS的類似蛋白PAP作為對照。 第二部分：天花粉蛋白誘導細胞ERSTRESS作用研究為了研究TCS引起的內質網應激(ERStress)現象，首先采用Westernblot方法檢測了TCS引起的內質網應激標志蛋白CHOP和BIP的表達，以

4、及CHOP誘導TRAIL受體蛋白DR5的上調情況；為了證明CHOP蛋白在TCS引起的細胞凋亡中的重要性，我們采用RNA干涉技術，將CHOPsiRNA轉染進入L929細胞中以將CHOP基因knock-down，觀察轉染前后細胞對TCS和TRAIL的敏感性的差異，用流式細胞術和MTT法測定TCS和TRAIL對上述兩種細胞的協(xié)同殺傷作用。 第三部分：AUTOPHAGY參與天花粉蛋白誘導的凋亡過程研究首先用Westernblot方法，檢

5、測了TCS誘導細胞自噬的標志蛋白LC3的轉化現象，再用雙熒光蛋白標記的-LC3質粒轉化進入細胞，并用激光共聚焦顯微鏡觀測了TCS處理下自噬體的形成現象，以本實驗室表達的PAP作為對照；為了進一步研究自噬在TCS誘導凋亡過程中的重要性，我們采用RNA干涉技術，通過siRNA轉染來分別knock-down與細胞自噬相關的基因Atg5、Atg7和Beclin，用Westernblot方法證實其表達水平；最后，用流式細胞術測定Atg5、Atg7

6、和Beclin基因knock-down細胞對用TCS和TRAIL處理的敏感性，來確定自噬過程對TCS引起的細胞凋亡的重要性。 研究結果： 第一部分：天花粉蛋白對腫瘤細胞凋亡和周期阻滯的影響L929細胞經不同劑量TCS處理24h后，有明顯的G0/G1期阻滯，并呈時間和劑量的依賴性，而當處理時間增加到48h后，高劑量組呈明顯的S期細胞周期阻滯。 MTT試驗證實，TCS對各種腫瘤細胞呈現細胞毒性作用，各種腫瘤細胞對TC

7、S處理的敏感性不同。用Hoechst33342和SytoxGreen染色經TCS處理的細胞可以在形態(tài)學上觀察到細胞凋亡。 TCS可以激活Caspase-3進而引起凋亡，PARP是Caspase-3的作用底物，因此能觀察到PARP的的裂解，并呈時間和劑量依賴關系，對照蛋白PAP也有類似的作用。當培養(yǎng)基中加入泛Caspase抑制劑zVAD，可以完全阻斷高劑量TCS處理Hela細胞引起的PARP的裂解，除見到PARP的裂解外，還可以見

8、到Caspase-3酶原的激活和總JNK激酶的磷酸化激活。 第二部分：天花粉蛋白誘導細胞ERSTRESS作用研究TCS可以引起L929細胞的內質網應激，首先伴隨著分子伴侶BIP的逐漸升高，在24h小時后有內質網應激標志蛋白CHOP的明顯表達，并觀察到TRAIL受體DR5表達水平升高，Caspase12酶原也是隨著時間逐漸地被激活。因為TCS可以上調DR5的表達，所以在TCS和TRAIL聯合應用時，呈現協(xié)同效應。用siRNA轉染L

9、929細胞后，CHOP基因knock-down細胞表現為對TRAIL和TCS聯合處理的敏感性降低。 第三部分：AUTOPHAGY參與天花粉蛋白誘導的凋亡過程研究微管相關蛋白1輕鏈3(microtubuleassociatedprotein1lightchain3，LC3)，是在真核細胞發(fā)現的自噬標志蛋白，Hela和L929細胞經TCS處理3～6h，用Westernblot可以見到LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉化；采用熒光雙標記的LC

10、3質粒可以檢測到TCS或PAP處理后Hela、HepG2和L929細胞有明顯的自噬體的形成現象。這些結果說明TCS引起的細胞凋亡過程伴隨自噬的產生，PAP也有類似的作用。 用MTT試驗表明：溶酶體蛋白酶抑制劑氯喹可以協(xié)同TCS的細胞毒性，而自噬激活劑雷帕霉素可以拮抗TCS的細胞毒性。 用siRNA干擾自噬基因Atg5、Atg7和Beclin。結果表明Atg5和Beclin基因Knock-down細胞對TCS的敏感性顯著增

11、高，細胞毒性分別升高4.16和1.87倍，說明自噬在TCS引起的凋亡過程中起到保護細胞的作用。 結論： (1)發(fā)現天花粉蛋白可以抑制多種腫瘤細胞的生長，其抗腫瘤作用是通過雙重機制即細胞周期阻滯和誘導凋亡來實現的； (2)天花粉蛋白可以引起明顯的內質網應激，可以誘導CHOP蛋白和BIP蛋白的表達； (3)天花粉蛋白可以通過內質網應激，促進TRAIL受體DR5的上調，增加腫瘤細胞對TRAIL的敏感性；