蟲草菌液抑制CSE誘導的人支氣管上皮細胞衰老的機制研究.pdf

1、慢性阻塞性肺疾病是一種進展性致殘性疾病，在有害因素的刺激下，氣道和肺產生異常炎癥反應。COPD的主要特點是持續(xù)氣流受限和不完全可逆的的氣道炎癥。
　　對COPD的細胞學、分子學以及遺傳學病因仍缺乏充分的了解，目前的治療都存在其不足，不能有效延緩疾病的進展或降低死亡率。
　　目前的研究證實，在老齡化人群中，因衰老過程加速可同時患有有多種疾病，被稱為共生疾病(multimorbidity)。包括COPD、冠心病、代謝性疾病以及神

2、經系統(tǒng)退變等慢性退行性疾病，他們有著共同的發(fā)病機制，與細胞的衰老加速密切相關。
　　細胞衰老是由各種壓力導致不可逆的生長停滯狀態(tài)的過程。老化過程中衰老細胞積聚，導致一系列衰老相關性疾病。研究證實，細胞衰老是共生疾病的共同原因。引起細胞衰老加速的機制涉及到端粒的縮短，PI3K/AKT/ mTor通路的活化，自噬受損，線粒體功能障礙，干細胞耗竭，免疫衰老等。很多這些途徑由慢性氧化應激驅動。
　　氧化應激是引起細胞衰老的重要原因。

3、在有氧代謝過程中產生的活性氧簇(reactive oxygenspecies，ROS)對大多數(shù)細胞都具有毒性作用。在正常情況下，機體內ROS的產生和ROS清除系統(tǒng)處于動態(tài)平衡狀態(tài)。如果ROS產生增多或/和機體清除ROS能力的下降，機體就會出現(xiàn)氧化應激(oxidative stress)。當機體處于氧化應激狀態(tài)時，體內組織細胞ROS量相對升高，超過機體的清除能力，可導致機體組織脂質過氧化水平升高，引起DNA氧化損傷和蛋白質的表達異常，對機

4、體造成損害。在COPD患者中，氧化應激主要來源于煙霧中的氧化劑和體內活化的炎癥細胞，吸煙與ROS及氧化應激密切相關。ROS活化PI3K，通過AKT激酶活化mTor，激活PI3K/AKT/ mTor通路。PI3K/AKT/ mTor通路作為細胞內非常重要的信號轉導途徑，參與調控細胞的生長、存活、增殖、凋亡、血管生成、自吞噬等過程。在細胞的衰老過程中，該通路也起著至關重要的作用。H3K/AKT/mTor通路活化后，通過ULK1的激活和抑制S

5、IRT1的活性，進而加速細胞衰老。
　　綜上所述，抑制細胞衰老的加速，對COPD以及其他共生疾病有一定的治療作用。
　　近年來，從我國傳統(tǒng)中草藥中提取藥物治療慢性疾病已經成為當前國內中醫(yī)藥現(xiàn)代化的重要組成部分。冬蟲夏草(Cordyceps sinensis)，又名蟲草，是麥角菌科真菌冬蟲夏草寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復合物，是世界上目前最稀有珍貴的藥用真菌之一，有極高的醫(yī)療保健作用和經濟價值，具有抗衰老、抗病

6、原微生物、抗惡性腫瘤、擴張血管、改善動脈硬化癥、調節(jié)內分泌、呼吸、免疫、神經系統(tǒng)及腎臟和肝臟等多種功效。
　　現(xiàn)在對于蟲草的研究主要集中在化學成分和藥理作用。蟲草中含有核苷、多糖、甾醇、蛋白質、氨基酸、多肽等，在抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗凋亡和免疫調節(jié)等方面發(fā)揮重要作用。但冬蟲夏草的具體作用機制尚不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草可以降低人肺上皮細胞的氧化應激損傷，抗氧化是冬蟲夏草的重要作用機制。呼吸系統(tǒng)中的氧化應激主要來源于煙霧，與細胞衰

7、老密切相關。
　　本實驗擬研究蟲草菌液對于CSE(香煙煙霧提取物，Cigarette SmokeExtract)誘發(fā)的細胞哀老的抑制作用及其機制。從細胞分子機制延緩COPD細胞的衰老，對以后COPD病人的疾病預防及治療提供一定的價值。
　　目的：
　　1.探討CSE對人支氣管上皮細胞存活率的影響。
　　2.研究CSE誘導人支氣管上皮細胞衰老。
　　3.研究冬蟲夏草菌液對于CSE誘導的細胞的衰老的抑制作用。<

8、br>　　4.研究ROS和PI3K/AKT/mTor通路在CSE誘導細胞衰老中的作用。
　　5.探討CSE和蟲草菌液對于細胞衰老的作用機制。
　　方法：
　　1.人支氣管上皮細胞(16HBE)進行體外培養(yǎng)，用不同濃度CSE對細胞進行干預不同時間，以MTT法測定細胞存活率，測定CSE對上皮細胞存活率的影響，確定最合適干預的CSE濃度和時間。
　　2.16HBE細胞經過上述實驗確定的濃度和時間的CSE干預后，通過SA

9、-β-gal染色法和P16、P21檢測細胞衰老。通過對培養(yǎng)細胞進行衰老相關的β半乳糖苷酶染色，計算視野中染色細胞的百分數(shù)，與對照組進行對比，P＜0.05具有顯著差異。P16和P21的檢測通過免疫熒光化學技術定性，實時定量聚合酶鏈反應測定mRNA相對表達，以及免疫蛋白印跡法測定蛋白表達定量。同時，以梯度CSE處理細胞，免疫蛋白印跡法測定P16和P21的蛋白表達。
　　3.在實驗組進行CSE干預的兩小時前加入CS（蟲草菌液，Cordy

10、ceps sinensis），細胞培養(yǎng)后進行衰老相關指標的檢測。測定β-半乳糖苷酶染色陽性細胞率，免疫熒光、實時定量聚合酶鏈反應、免疫蛋白印跡測定P16、P21表達。
　　4.為測定ROS和PI3K/AKT/mTor通路的活化，16HBE細胞經過CSE、CS處理后，通過ROS試劑盒檢測ROS熒光，定性分析不同干預條件下ROS變化;通過免疫蛋白印跡測定PI3K、AKT、mTor蛋白表達以及它們的磷酸化蛋白表達;以梯度CSE處理細胞，

11、免疫蛋白印跡法測定AKT、mTor的磷酸化蛋白表達。
　　5.為了研究CSE和蟲草菌液對于細胞衰老的作用機制，在CSE組、CS+CSE組中，我們分別加入ROS抑制劑NAC、PI3KK抑制劑Ly294002，測定ROS熒光強度、PI3K/AKT/mTor以及它們的磷酸化蛋白表達，以觀察加入抑制劑后對細胞通路的影響，測定β-半乳糖苷酶染色和P16、P21的蛋白表達觀察對細胞衰老的影響。
　　結果：
　　1.經過CSE處理后

12、，16HBE細胞存活率被抑制，呈時間和濃度依賴性。根據(jù)MTT法繪制細胞生存率曲線，2％CSE作用24小時用于之后的干預研究。
　　2.經過CSEE處理后，16HBE細胞的衰老增強。對比對照組，SA-β-gal染色陽性細胞比率增高(p＜0.05)，P16和P21的免疫化學熒光增強，P16和P21的mRNA相對表達增加（分別為:p＜0.05，p＜0.05），P16和P21蛋白表達量增加（分別為:p＜0.05，p＜0.05）。P16和P

13、21的蛋白表達量隨CSE的作用濃度和作用時間而增加(分別為:p＜0.05，p＜0.05)。
　　3.與CSE處理細胞組進行對比，在CSEE干預前加入CS組細胞的衰老減弱。與CSE組對比，CSE+CS組的SA-β-gal染色陽性細胞比率降低(p＜0.05)，P16和P21的免疫化學熒光減弱，mRNA相對表達減少（分別為:p＜0.05，p＜0.05），蛋白表達量減少（分別為:p＜0.05，p＜0.05）。
　　4.與對照組相比較

14、，CSE組細胞ROS熒光增強，PI3K、AKT、mTor蛋白表達無差異，AKT、mTor磷酸化蛋白表達增加（分別為:p＜0.05，p＜0.05）。對比CSE組，預先加入CS組細胞的ROS熒光減弱，PI3K、AKT、mTor蛋白表達無差異，AKT、mTor磷酸化蛋白表達減少（分別為:p＜0.05，p＜0.05）。AKT、mTor磷酸化蛋白表達呈CSE濃度和時間依賴性（分別為:p＜0.05，p＜0.05）。
　　5.加入ROS抑制劑N

15、AC后，CSE組、CS+CSE組細胞的ROS熒光均呈明顯減弱，AKT、mTor磷酸化蛋白表達均減少（分別為:p＜0.05，p＜0.05，p＜0.05，p＜0.05），由此，ROS和PI3K/AKT/mTor信號通路活化降低;加入NAC后，CSE組、CS+CSE組細胞衰老減弱，表現(xiàn)為SA-β-gal染色陽性細胞的比率均有降低(分別為:p＜0.05，p＜0.05)、P16和P21蛋白表達均呈下降(分別為:p＜0.05，p＜0.05，p＜0.

16、05，p＜0.05)。
　　加入PI3K抑制劑Ly294002后，CSE組、CS+CSE組細胞的AKT、mTor磷酸化蛋白表達明顯減少（分別為:p＜0.05，p＜0.05，p＜0.05，p＜0.05），由此，信號通路活化降低，但ROS熒光變化不明顯，PI3K抑制劑對ROS影響不大;加入Ly294002后，CSE組、CS+CSE組細胞衰老減弱，表現(xiàn)為SA-β-gal染色陽性細胞的比率均有降低（分別為:p＜0.05，p＜0.05）、P

17、16和P21蛋白表達均呈下降(分別為:p＜0.05，p＜0.05，p＜0.05，p＜0.05)。
　　結論：
　　1.CSE抑制人支氣管上皮細胞存活率，呈時間和濃度依賴性。
　　2.CSE可以誘導人支氣管上皮細胞衰老。
　　3.CS在體外細胞培養(yǎng)中能抑制CSE誘導的細胞衰老。
　　4.ROS和P13K/AKT/mTor信號通路在CSE誘導的細胞衰老中起著重要的作用。
　　5.阻斷ROS/mTor信號通