自噬在慢性砷誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化中的作用.pdf

1、目的：
　　長(zhǎng)期暴露于砷污染中時(shí)可以誘導(dǎo)多種腫瘤的發(fā)生。皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal Transition）是腫瘤發(fā)生的一個(gè)重要步驟，自噬是細(xì)胞用來對(duì)抗自身轉(zhuǎn)化的自我保護(hù)機(jī)制，本文旨在探討人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B經(jīng)慢性亞砷酸鈉誘導(dǎo)后，自噬在BEAS-2B轉(zhuǎn)化中的作用。
　　方法：
　　1.BEAS-2B細(xì)胞處理
　　用2.5 ummol/L亞砷酸鈉誘導(dǎo)48h為急性砷誘導(dǎo)；用0.2

2、5ummol/L亞砷酸鈉誘導(dǎo)66天為慢性砷誘導(dǎo)；對(duì)照組 BEAS-2B相同條件無亞砷酸鈉培養(yǎng)66天；Beclin-1shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BEAS-2B細(xì)胞抑制自噬；10nM雷帕霉素作用BEAS-2B細(xì)胞24h增強(qiáng)自噬；10nM巴弗洛霉素A1作用BEAS-2B細(xì)胞24 h抑制自噬。
　　2.集落形成實(shí)驗(yàn)
　　經(jīng)0.25uM亞砷酸鈉暴露培養(yǎng)66天的BEAS-2B細(xì)胞，進(jìn)行軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)，14天后顯微鏡下觀察克隆形成情況，挑取細(xì)

3、胞克隆消化培養(yǎng)為轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
　　3.自噬檢測(cè)
　　Western Blot檢測(cè)各組自噬標(biāo)志蛋白Beclin-1，LC3Ⅱ，P62，觀察自噬的活性；細(xì)胞經(jīng)單丹磺酰戊二胺染色（MDC）染色,熒光顯微鏡觀察自噬小體綠色熒光信號(hào)。
　　4.上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）標(biāo)志物和炎性體相關(guān)蛋白檢測(cè)
　　調(diào)節(jié)自噬，Western Blot檢測(cè)上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白Vimentin、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白A

4、SC表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1. BEAS-2B細(xì)胞經(jīng)慢性亞砷酸鈉暴露66天，克隆形成率為22.77％，較對(duì)照組（3.06%）具有顯著差異（p<0.01）；
　　2.慢性砷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的BEAS-2B細(xì)胞，形態(tài)由上皮細(xì)胞的不規(guī)則多邊形變?yōu)樗笮危怀晒⒏鹘M細(xì)胞，獲得pDNA-Beclin1shRNA質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
　　3.急性砷誘導(dǎo)組 beclin-1蛋白、LC3Ⅱ蛋白的表達(dá)最高，慢性砷誘導(dǎo)組beclin-1蛋

5、白、LC3Ⅱ蛋白的表達(dá)較前者下降，但仍然高于對(duì)照組；而這兩組細(xì)胞自噬降解蛋白P62的表達(dá)低于對(duì)照組。
　　4.與對(duì)照組相比，急性砷誘導(dǎo)組和慢性砷誘導(dǎo)組MDC染色顯示較強(qiáng)的綠色熒光信號(hào)，其中急性砷誘導(dǎo)組熒光信號(hào)最強(qiáng)。
　　5.以雷帕霉素促進(jìn)自噬，上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)增多，而間質(zhì)標(biāo)志蛋白vimentin表達(dá)下降；而以巴弗洛霉素A1抑制自噬后，結(jié)果正相反。
　　6.IL-1β成熟體與凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白ASC的