小G蛋白R(shí)ac1及其上游調(diào)控分子OCRL1在骨關(guān)節(jié)炎疾病發(fā)展及治療中的作用研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 Rac1在軟骨細(xì)胞肥大鈣化及骨關(guān)節(jié)炎病理中的作用研究
　　目前一種普遍認(rèn)同的理論認(rèn)為，在骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)的發(fā)生過(guò)程中，關(guān)節(jié)表面軟骨細(xì)胞發(fā)生了類似于軟骨發(fā)育中的軟骨內(nèi)成骨(EndochondralOssification)過(guò)程，導(dǎo)致了軟骨細(xì)胞的病理性肥大、鈣化(Hypertrophy andCalcification)，最后導(dǎo)致軟骨層遭到破壞。Rac

2、1(ras-Related C3 Botulinum ToxinSubstrate1)是烏苷三磷酸酶(guanosine triposphatase，GTP)家族中的重要成員，具有Rho類型的GTP酶結(jié)合區(qū)，與GTP和二磷酸鳥嘌呤核苷(guanosine diphosphate，GDP)有高度親和性，與GDP結(jié)合時(shí)失活，與GTP結(jié)合時(shí)激活。在C57小鼠的軟骨中特異性敲除Rac1，會(huì)導(dǎo)致軟骨內(nèi)成骨過(guò)程受阻，肢體發(fā)育變短;體外軟骨細(xì)胞中，R

3、ac1的過(guò)度表達(dá)會(huì)促進(jìn)軟骨細(xì)胞肥大標(biāo)志COLX promoter的活性升高，提示Rac1在軟骨發(fā)育過(guò)程中有促進(jìn)軟骨細(xì)胞肥大、鈣化的作用。然而，Rac1在軟骨細(xì)胞的病理性肥大、鈣化作用，以及骨關(guān)節(jié)炎疾病發(fā)展中作用的研究仍然較為缺乏。
　　本研究首次檢測(cè)了OA軟骨樣本及正常軟骨樣本中Rac1總表達(dá)量、活性的區(qū)別。我們首先發(fā)現(xiàn)，OA軟骨中Rac1活性異常升高，提示Rac1可能參與OA疾病的發(fā)展。為了驗(yàn)證Rac1在OA中的作用，我們通過(guò)前

4、交叉韌帶和半月板切除術(shù)(ACLT)構(gòu)建了小鼠OA模型，同時(shí)構(gòu)建了Rac1過(guò)度激活和Rac1失活兩種病毒載體，體外包裝病毒并濃縮，通過(guò)關(guān)節(jié)腔注射病毒濃縮液改變關(guān)節(jié)軟骨局部Rac1活性。術(shù)后8周對(duì)軟骨的組織學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Rac1活性升高顯著促進(jìn)軟骨基質(zhì)降解，促進(jìn)基質(zhì)降解酶MMP13、ADAMTS-5的分泌以及軟骨肥大鈣化標(biāo)志COLX和Runx2的表達(dá)。反之，降低Rac1的活性顯著減緩OA的發(fā)生。體外的機(jī)制研究表明，Rac1激活能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞

5、病理性的肥大、鈣化，而這種作用是通過(guò)促進(jìn)β-catenin核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)介導(dǎo)的。
　　第二部分 Rac1上游調(diào)控因子RhoGAP---OCRL1在調(diào)控Rac1活性及軟骨鈣化中的作用研究
　　第一部分研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)OA軟骨細(xì)胞中Rac1的活性異常升高，由于Rac1屬于小G蛋白家族，其活性的高低受細(xì)胞內(nèi)一些專門的上游調(diào)控因子調(diào)控。如鳥苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factor, GEF)能夠提高小

6、G蛋白活性，GTP酶活化蛋白(GTPase activating protein，GAP)能夠降低小G蛋白活性。因此，我們推測(cè)軟骨中某些GEF的上調(diào)或者某些GAP的下調(diào)導(dǎo)致了Rac1的活性的異常升高。
　　通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)，我們比較了正常關(guān)節(jié)軟骨組織和骨關(guān)節(jié)炎病變軟骨組織中20個(gè)GEF基因和8個(gè)GAP基因的表達(dá)差異。結(jié)果顯示，在這些組織中，20個(gè)GEF因子的表達(dá)沒(méi)有顯著性升高，而我們所檢測(cè)的GAP蛋白中，OCRL1是唯一一個(gè)

7、有顯著性下降的GAP基因。體外軟骨鈣化模型中，當(dāng)向軟骨細(xì)胞中轉(zhuǎn)入外源性O(shè)CRL1質(zhì)粒后，通過(guò)堿性磷酸酶染色(ALP)及其灰度定量可以發(fā)現(xiàn)，IL1β、TGFα和TNFα促進(jìn)軟骨細(xì)胞鈣化的作用被明顯抑制。相反的，當(dāng)用小干擾RNA(siRNA)敲降OCRL1后，IL1β、TGFα和TNFα引起的軟骨細(xì)胞的鈣化作用會(huì)被加強(qiáng)。軟骨細(xì)胞中過(guò)表達(dá)OCRL1能夠阻斷ILβ導(dǎo)致Rac1的過(guò)度激活。相反的，siRNA敲降OCRL1能夠進(jìn)一步提高軟骨細(xì)胞中R

8、ac1的活性。分段克隆OCRL1RhoGAP domain和非RhoGAP domain分別過(guò)表達(dá)于軟骨細(xì)胞中并檢測(cè)對(duì)軟骨細(xì)胞病理變化的影響，發(fā)現(xiàn)OCRL1對(duì)軟骨細(xì)胞的Rac1活性調(diào)節(jié)是通過(guò)其上的RhoGAPdomain起作用的。最后，我們研究了體內(nèi)OCRL1在小鼠ACLT造成的OA疾病發(fā)展中的作用。GFP對(duì)照和OCRL1慢病毒包裝后，經(jīng)濃縮后關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射。術(shù)后6周，外源性的GFP和HA檢測(cè)證實(shí)病毒成功感染小鼠關(guān)節(jié)表面軟骨，同時(shí)Rac1

9、的活性隨著外源性O(shè)CRL1的轉(zhuǎn)入顯著降低。Safranin Orange組織學(xué)染色結(jié)果可以看到，GFP對(duì)照小鼠的關(guān)節(jié)表現(xiàn)出典型OA病理改變，如軟骨基質(zhì)染色變淺，軟骨產(chǎn)生明顯缺損。而OCRL1組小鼠的關(guān)節(jié)軟骨保存較為完整，軟骨基質(zhì)染色顏色也較深，只有在脛骨平臺(tái)靠近內(nèi)側(cè)半月板的部分軟骨，表面有纖維狀軟骨出現(xiàn)。同時(shí)對(duì)比GFP組，OCRL1組關(guān)節(jié)軟骨表達(dá)更少的MMP13、ADAMTS-5和COLX。
　　第三部分 靶向Rac1的骨關(guān)節(jié)炎治

10、療及骨軟骨缺損修復(fù)研究
　　最后，為了更好的靶向Rac1干預(yù)骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展，該研究創(chuàng)新地運(yùn)用殼聚糖微球包裹Rac1小分子抑制劑NSC23766，在關(guān)節(jié)腔內(nèi)進(jìn)行緩釋。我們分別在小鼠ACLT關(guān)節(jié)不穩(wěn)定OA模型和大鼠關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)兩種動(dòng)物模型中，檢測(cè)了Rac1殼聚糖緩釋微球的潛在治療作用。
　　小鼠OA術(shù)后4周、6周和8周的樣本組織學(xué)檢測(cè)表明，OA關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射包裹NSC23766微球可以顯著降低軟骨細(xì)胞中Rac1活性，同時(shí)抑制軟骨